GYY4137对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠的实验研究

王朝迅 王聪聪 贺艳菊 李秀财 谷成英 周里钢

上海市浦东医院 复旦大学附属浦东医院内分泌科，上海 201399

随着许多国家人口老龄化的不断增加，骨质疏松已成为一种较为常见的临床诊断。骨质疏松常见于绝经后妇女，诊断通常为绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。骨质疏松最常见的治疗方法之一是外源性激素替代疗法。然而，这会增加生殖系统肿瘤的风险[1]。双膦酸盐长期使用可导致颌骨坏死和长骨不典型骨折[2]。重组甲状腺激素(PTH)药物已被证明能直接促进骨形成，但同时刺激破骨细胞生成，增加骨吸收[3]。因此，寻找新的治疗方法具有重要的临床意义。H2S作为一种还原剂，在生理浓度上具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用[4]。血浆内源性H2S浓度与衰老速度和氧化应激水平呈负相关[5]。目前普遍认为氧化应激在PMOP中起重要作用。一些研究证实外源性H2S通过ERK1/2依赖的抗氧化机制促进成骨细胞的形成和分化，成功地抑制了过氧化氢对成骨细胞株MC3T-E1的氧化损伤[6]。GYY4137是近几年发展起来的一种新型硫化氢控释剂，它缓慢而持续地在体内释放H2S，极少有毒性。它能模拟内源性H2S的形成，作为外源供体具有优于硫化钠的优势[7]。本研究探讨GYY4137对去卵巢诱导的骨质疏松大鼠模型的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物和治疗方案

80只6月龄雌性Sprague-Dawley大鼠[(265±15)g，上海史莱克实验动物]，将它们饲养在温度为(23±2)℃，相对湿度为(55±10)%，并且常规12 h光照循环的房间中。由指定的人喂养，可以自由地吃喝。在进行骨质疏松症模型之前使大鼠适应环境1周。

将80只大鼠随机分成4组，每组20只：假手术组(Sham)、卵巢切除组(OVX)、卵巢切除组用阿仑膦酸钠治疗(OVX-ALEN)和卵巢切除组用GYY4137处理(OVX-GYY)。OVX-ALEN和OVX-GYY为治疗组。GYY4137购自Santa Cruz Biotechonology(SC-224013)并用0.9%生理盐水稀释。阿仑膦酸钠的商品名为A115345，用0.9%生理盐水稀释。在手术前将大鼠禁食过夜，自由饮水。通过腹膜内注射320 mg/kg的剂量水合氯醛(Sangon Biotech)来麻醉所有大鼠。固定在背上，腹部消毒，腹部中间切开了一个切口。发现子宫双峰和双侧卵巢，并分离出周围的脂肪组织。手术期间注意止血，术后用青霉素(40 000 U/只)治疗大鼠3 d以避免感染。对于Sham，在分离卵巢后缝合切口。对于OVX、OVX-ALEN和OVX-GYY，完全进行卵巢切除术并缝合切口。术后OVX-ALEN组以1 mg/kg的剂量皮下给予阿仑膦酸钠(A115345)，OVX-GYY组以100μg/kg的剂量腹腔注射GYY4137。所有大鼠的给药频率每2 d一次。在第2、4、8和12周结束时，随机选择5只大鼠，通过乙醚吸入麻醉并从腹主动脉采集血液。分离血浆，完全取出两股股骨，用生理盐水饱和的纱布包裹分别标记，并在80 ℃保存在冷冻器中。研究期间没有意外死亡，实验持续时间为12周。

1.2 检测指标

1.2.1血清学指标检测：使用磷测定试剂盒(Solarbio，China)通过磷钼酸UV比色法测定血磷水平。用分光光度计(ThermoFisher，USA)测量磷酸盐吸光度和浓度。使用罗氏自动生化分析仪(cobas 8000 c702)通过比色法测定血钙水平。使用罗氏碱性磷酸酶试剂盒，采用速度法测量ALP水平。分别使用罗氏骨钙素或降钙素试剂盒，采用化学发光测定OCN和降钙素的水平。使用罗氏甲状旁腺激素检测试剂盒和罗氏自动生化分析仪，采用电化学发光测量对甲苯哒啉的水平。使用Huamei Rat Leptin LEP ELISA试剂盒，采用ELISA(酶联免疫吸附测定)测定瘦素的水平。改进的亚甲蓝法用于测定血浆中的H2S水平。

1.2.2骨密度和生物力学检测：骨密度的测定使用Hologic Double Energy X Ray 4 500 W骨密度计系统(DEXA)测量腰4～5椎体骨密度。大鼠股骨生物力学改变使用ElectroForce 3200 Series II测试仪器(BOSE)采用三点弯曲实验测量股骨骨折期间的最大应力。

1.2.3组织学检测：左股骨使用苏木精伊红染色观察，在4%多聚甲醛中固定后，将每个股骨样品脱钙，在乙醇中以递增浓度脱水，在二甲苯中洗涤并植入组织石蜡中。最后，使用5 μm切片进行H&E染色。

1.3 统计学分析

实验数据表示为均数±标准差。统计分析用SPSS 22.0软件进行。基于方差结果的同质性检验，使用Student'st检验比较两个不同组间差异。以P<0.05判断差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨量的改变

OVX组显示出明显的骨小梁的减少，Sham组、OVX-ALEN组和OVX-GYY组的骨小梁较OVX组明显增加，无明显骨量减少(图1)。

图1 治疗12周时大鼠股骨H&E染色切片(×40)Fig.1 HE staining of the femur in rats after 12 weeks of the treatment (×40)

2.2 血清指标的改变

与假手术组比，OVX和OVX-ALEN组的H2S水平显著下降，但OVX-GYY组的水平没有显著差异(图2)。与Sham组相比，OVX组的ALP水平在第4周显著下降(P<0.05)。8周后，OVX-GYY组的ALP水平显著增加，但未能恢复至2周水平(P<0.05)。 12周后，OVX、OVX-ALEN和OVX-GYY组的ALP水平显著增加(P<0.05)。然而，ALEN治疗显著降低了第8周的OCN水平(P<0.05)，而12周后的ONC水平显著高于经过OVX手术的组(P<0.05)。与假组相比，在第4、8和12周后，PTH水平在经历过OVX手术的组中增加(P<0.05)。同样，OVX组的瘦素水平在第4、8和12周上升(P<0.05)。卵巢切除术后，降钙素水平随时间降低(图2)。

图2 GYY4137对卵巢切除大鼠血浆中硫化氢、钙、磷和骨代谢量的影响。在4组大鼠中评估碱性磷酸酶(A)、骨钙素(B)、降钙素(C)、PTH(D)、瘦素(E)、硫化氢(F)、钙(G)和磷(H)的水平。与Sham组相比，*P<0.05；与Sham组相比，**P<0.01；与OVX组相比，#P<0.05；与OVX相比，##P<0.01Fig.2 Effect of GYY4137 on hydrogen sulfide, plasma calcium, phosphorus and bone metabolism in ovariectomized rats. Levels of alkaline phosphatase(A), osteocalcin(B), calcitonin(C), PTH(D), leptin(E), hydrogen sulfide(F), calcium(G) and phosphorus(H) were evaluated in all four groups of rats. *P<0.05 compared to the Sham group; **P<0.01 compared to the Sham group; #P<0.05 compared to the OVX group; ##P<0.01 compared to OVX.

2.3 骨密度和生物力学改变

与Sham组相比，OVX组中股骨的BMD在第8、12周下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。 GYY4137治疗缓解了12周内BMD的下降(P<0.05)，治疗效果优于OVX-ALEN组(图3)。 GYY4137改善了卵巢切除术引起的骨质疏松症的最大骨应力。通过三点弯曲试验测试了股骨骨折的最大应力(图3)。结果显示，12周后，OVX组的最大应力降低。OVX组骨质疏松症建模以与骨质疏松症的影响一致的方式改变股骨的最大生物力学负荷。与Sham组相比，用阿仑膦酸盐或GYY4137治疗的大鼠在最大生物力学负荷方面没有显著差异(P>0.05)。 OVX-ALEN和OVX-GYY组也未显示出显著差异(P>0.05，图3)。

图3 股骨骨密度和强度试验结果。BMD测量值用于第8周的股骨骨密度(A)，股骨BMD在第12周(B)，OVX模型在第8周(C)，OVX模型在第12周(D)Fig.3 The results of the bone mineral density and strength test for the femur. The BMD measurements of the femur were performed on week 8 (A) or week 12 (B) in Sham rats, and on week 8(C) or week 12(D) in the OVX rats.

3 讨论

作为内源性气体信号分子，H2S是一个热门的研究课题。多次研究证实了其在许多组织系统的生理和病理过程中的重要作用，包括内脏、心血管、骨骼和神经系统。例如，它可以保护心肌细胞免受缺血性疾病[8]。内源性H2S的减少可加速动脉粥样硬化[9]。它还可以削弱对神经系统氧化应激的保护作用[10]。雌激素促进骨形成，主要由成骨细胞上的ER受体介导；还通过其ER受体诱导的破骨细胞凋亡抑制骨吸收；而骨代谢依赖于成熟和成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收的平衡[11]。

血浆中的钙和磷水平与骨骼中的水平保持动态平衡，血浆水平反映骨组织的代谢和小肠与肾脏对钙和磷的吸收重吸收率。在这项研究中，笔者研究了雌激素缺乏对大鼠血浆中H2S、钙和磷酸盐水平，骨骼宏观力学和物理学以及相关激素分泌的影响。研究了GYY4137和阿仑膦酸钠如何影响这些参数。在生物力学和生化指标方面，OVX-GYY组与Sham组相比没有显著差异。外源性GYY被证明可以提高大鼠血浆中的H2S水平，并改善由于去卵巢而导致的钙和磷酸盐的不平衡。H&E染色和显微镜观察也证明，在GYY干预下，OVX-GYY组的骨小梁结构和数量与假手术组或OVX-ALEN组的结果无显著差异。除直接作用于骨代谢外，雌激素可以增加降钙素的分泌，抑制甲状旁腺素的分泌，促进肾脏中维生素D的活化，并通过钙调节激素增加小肠中的钙吸收。

降钙素是甲状腺C细胞分泌的一种多肽激素。它作用于降钙素受体，抑制破骨细胞的活化，刺激成骨细胞的增殖，并防止细胞凋亡[12]。降钙素还可间接抑制甲状旁腺和维生素D的活化，降低血液中钙的含量。其水平与年龄无关，因此降钙素和代谢率的基本上对于骨质疏松症患者没有显著变化，这与本研究结果一致。甲状旁腺以脉冲方式分泌甲状旁腺素，作用于成骨细胞的甲状旁腺素受体以增强骨形成。甲状旁腺素的异常分泌，如由甲状旁腺功能亢进引起的持续丰富的分泌，可以增加破骨细胞的活性，导致骨吸收和骨质疏松症。本研究表明，甲状旁腺素水平随着时间的推移而降低，这可能与血浆中雌激素的减少有关。在OVX-ALEN组中，阿仑膦酸钠调节降钙素和甲状旁腺素。然而，GYY对OVX-GYY组中的这两种激素没有显著的调节作用。

瘦素是一种由白色脂肪组织分泌的全身激素，与骨代谢有更复杂的调节关系。通常认为它作用于下丘脑长受体以通过神经内分泌轴调节骨代谢[13]。它还可以通过骨组织周围的短受体直接调节骨代谢。本研究观察到H2S可能有助于调节瘦素水平。血浆中大约50%的ALP来自成骨细胞[14]。OCN是由成骨细胞直接分泌和表达的活性多肽，它们都反映了成骨细胞的活性和状态，代表了骨形成和重建[14]。有趣的是，阿仑膦酸钠和GYY4137均未对OVX组中的ALP或OCN产生显著的调节作用，这需要进一步研究。

一些研究表明，由间充质干细胞产生的H2S可以调节骨骼分化，并且H2S的减少可以减少钙通道的硫化，从而影响Ca2+通路的内部流动；这会减少间充质干细胞向成骨细胞的分化[15]。在一些实验中，还观察到H2S介导氧化应激损伤，促进成骨细胞的增殖和分化[16]。这些陈述与本研究的结果一致，表明H2S对骨代谢的益处及其改善骨质结构的潜力。外源性H2S可以介入和调节卵巢切除大鼠的骨质疏松症。在某些情况下，它甚至可以治愈由卵巢切除术引起的骨质疏松症[17]。

总之，卵巢切除的大鼠在本研究中用作受试者，以探索血浆中内源性H2S水平与骨质疏松症之间的关联。通过腹腔注射GYY4137作为内源性H2S的补充，本实验发现提高和维持血浆中H2S的生理水平可以调节钙和磷的代谢平衡，且骨代谢的常见临床指标的影响如OCN、钙调素、碱性磷酸酶、甲状旁腺素和瘦素。研究结果表明，GYY4137是一种比阿仑膦酸钠更好的干预措施，对卵巢切除术引起的骨质疏松症有一定的治疗作用。