中药活性成分靶向激活AMPK防治骨质疏松症的研究进展

孙娜 张丽妍 徐钢 李忠海

1.大连市第三人民医院，辽宁 大连 116091 2.大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连 116011 3.辽宁省骨相关疾病修复重塑分子机制重点实验室，辽宁 大连 116011

高致残和致死率的骨质疏松骨折是严重影响个体生活质量的棘手难题。在防治方面，缺少靶点明确和药效显著的特效药已成为亟待解决的临床难题[1-2]。AMP活化蛋白激酶(AMPK)，是由一个催化α亚基和两个调节亚基(β和γ)组成的异源三聚体酶复合物，是细胞的能量感受器。据研究表明，在由骨髓间充质干细胞(BMSCs)、成骨细胞和破骨细胞等构成的骨多细胞单位中，以激活AMPK为中心的信号网在骨质疏松的关键病因——骨重建失衡中发挥着重要作用，在骨质疏松症发病机制中占据重要地位[3-4]。本文以中药激活AMPK靶点防治骨质疏松症为研究证据，论证靶向激活AMPK作为防治骨质疏松症的新方向。

图1 促进BMSCs成骨分化抑制成脂分化、促进成骨细胞分化和抑制破骨细胞分化的AMPK信号通路Fig.1 The AMPK signaling pathway that promotes BMSCs osteogenic differentiation, inhibits lipid differentiation, promotes osteoblast differentiation, and inhibits osteoclast differentiation

1 AMPK促进BMSCs向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化

在小鼠间充质干细胞C3H10T1/2中，激活AMPK可以通过Wnt/β-catenin信号通路而促进成骨分化抑制成脂分化，通过PPAR-γ促进成脂分化而抑制成骨分化[5]。在BMSCs的成骨分化过程中，AMPK通过ERK途径而影响Runx-2和PPAR-γ的表达等[6]，AMPK/mTOR信号轴控制BMSCs向成骨细胞分化[7]。另外，在模拟BMSCs成骨分化和成脂分化的小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和小鼠前脂肪细胞3T3-L1模型中，过表达AMPK均通过AMPK/Gfi1/OPN信号轴分别促进前者的成骨分化和抑制后者的成脂分化[8]。综上，激活的AMPK可以通过以上4条信号通路来促进BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化(图1)。

中药虎杖、桑椹等所含多酚类化合物白藜芦醇通过激活AMPK而抑制内源性活性氧的产生从而改善衰老BMSCs的成骨分化作用，其可能通过SIRT1或者LKB1激活AMPK/mTOR信号轴而抑制活性氧的产生，进而促进成骨分化[9]。

2 AMPK促进成骨细胞分化

AMPKα1催化亚基敲除小鼠出生后发育迟缓，松质骨体积和皮质骨长度和密度均减少，而股骨皮质疏松增加，并出现颅骨缺损；在原代培养的颅骨AMPK-/-成骨细胞中，成骨标志物均显著减少，而骨转换增加[10]；较早研究报道脂联素通过脂联素受体激活AMPK信号通路而诱导人源成骨样细胞hFOB中骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2表达[11]；在小鼠MC3T3E1成骨细胞中，激活的AMPK通过BMP-2/Smad信号通路[12-13]和Smad/Dlx5/Runx-2信号通路[12]促进成骨分化，增加I型胶原蛋白(type I collagen，Col-Ⅰ)和成骨相关转录因子Osterix(Osx)的mRNA表达，增加碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨钙素(osteocalcin，OCN)的蛋白表达量；在大鼠UMR-106成骨细胞中，激活的AMPK可以通过磷酸化β-catenin的Ser552位点促进后者核移位，导致淋巴增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)/T细胞因子(T-cell factor，TCF)转录因子的激活，促进成骨细胞增殖和分化[14]；另外，经典的激活的Wnt与低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)等结合促使糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3β失活而增加胞质内β-catenin积累并促进核移位进而通过LEF/TCF可以激活MC3T3-E1成骨细胞中BMP-2的表达发挥促成骨作用[15]。综上所述，激活的AMPK可能包括直接通过BMP-2/Smad/Runx-2信号通路促进成骨分化或者通过Wnt/β-catenin信号通路来促进成骨细胞增殖和分化(图1和2)。

人参皂苷Rd激活AMPK/BMP-2信号途径促进成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化和矿化[13]；博落回、白屈菜和血水草中血根碱激活AMPK/BMP-2/Smad1信号途径促进成骨细胞MC3T3-E1的分化，其促成骨的效果在卵巢切除致骨质疏松模型大鼠中得到验证[16]。骨碎补等所含柚皮苷可以激活AMPK/β-catenin信号途径促进大鼠UMR-106成骨细胞增殖和分化[14]；当归、黄芪、葛根和鸡血藤等所含芒柄花黄素激活AMPK/β-catenin信号途径抑制脂肪形成，改善高脂饮食诱导C57BL/6小鼠的肥胖和骨丢失[17]。此外，毛果鱼藤(土甘草)中黄铜活性成分高山异黄酮(Alpinumisoflavone)通过激活AMPK/NOX-2信号途径抑制活性氧产生而缓解糖皮质激素诱导的骨细胞凋亡[18]。

图2 成骨细胞中AMPK/β-catenin/BMP-2促成骨信号通路Fig.2 AMPK/β-catenin/BMP-2 signal pathway to promote osteogenesis in osteoblasts

3 AMPK抑制破骨细胞分化

在AMPK催化亚基敲除小鼠中，多核的破骨细胞形成增加，加速破骨细胞的分化[19]。在原代培养的小鼠破骨细胞中，激活AMPK能够通过抑制NF-κB、JNK、p38、Akt、c-Fos和NFATc1而抑制破骨细胞形成和骨吸收[20]，通过c-Fos/NFATc1信号通路来负调节破骨细胞分化[20-22]。综上，激活的AMPK可以通过c-Fos/NFATc1信号通路来抑制破骨细胞分化(图1)。

在卵巢切除诱导的小鼠模型中，豚草中高车前素激活AMPK信号途径而发挥抗骨质疏松作用[23]。绿茶中儿茶素没食子酸酯(绿茶多酚)通过下调c-Fos的表达、抑制NF-κB信号途径而抑制破骨细胞生成[24]；儿茶素没食子酸酯还可以激活AMPK抑制骨吸收而缓解卵巢切除诱导的大鼠骨丢失[25]。

4 总结与展望

在BMSCs中，Wnt/β-catenin信号通路对于促进其成骨分化、抑制成脂分化等起到重要作用[26]；此外，ERK和mTOR信号通路也均受AMPK调控而影响其成骨成脂的分化调节[27]。最近研究发现，过表达AMPK可以影响一种多域、多功能的转录因子Gfi1，从而上调OPN，调控成骨成脂分化[8]。在成骨细胞中，除经典的Wnt/β-catenin信号通路外，BMP/Smad/Runx-2信号通路与骨形成密切相关，BMP-2可以激活Smad调节成骨转录因子Runx-2和Osx等发挥作用[28]。在破骨细胞中，c-Fos和NFATc1是破骨细胞生成的两个重要因子，能够促进下游降钙素受体和抗酒石酸酸性磷酸酶等的基因表达[29]。

中医根据骨质疏松起病于中、老年，以腰背痛、驼背、易骨折为主症的特点，将其归属中医学“骨痿”“骨枯”“骨缩”的范畴。常见抗骨质疏松中药包括淫羊藿、骨碎补、补骨脂、蛇床子、杜仲、续断、地黄和狗脊等[30-35]。其中，淫羊藿、骨碎补、蛇床子、补骨脂可通过上调BMP-Smads、Wnt/β-catenin信号通路中BMP-2、Smad1/5/8、Wnt3a及β-catenin等关键蛋白及基因的表达，促进成骨细胞的骨形成[28，30]；淫羊藿、骨碎补和补骨脂等通过介导OPG/RANKL/RANK信号通路，上调OPG和OPG/RANKL的表达，抑制破骨细胞的骨吸收[30]。淫羊藿中的淫羊藿苷、骨碎补中的柚皮苷和补骨脂中的补骨脂素等既可以通过调控BMP-Smads、Wnt/β-catenin等信号通路促进骨形成，又可以活化OPG/RANKL/RANK、CTSK等信号通路抑制骨吸收[30]。这些抗骨质疏松中药及活性成分作用的促成骨和抑破骨信号通路均为AMPK信号途径的下游，其是否同时激活AMPK信号途径尚不明确，仍有待后续实验验证。此外，对于地黄和狗脊及其活性成分的抗骨质疏松作用机制是否与激活AMPK相关等问题，仍有待深入研究[33-35]。

从该综述的文献结果中可以看出，靶向激活AMPK信号途径发挥抗骨质疏松作用的中药活性成分既包含上述常见抗骨质疏松中药活性成分如柚皮苷和白藜芦醇等，又包含一些新的抗骨质疏松中药活性成分如血根碱、高车前素和绿茶多酚等，关于这些活性成分对于成骨细胞的影响报道较多，而对于BMSCs和破骨细胞的研究报道较少，后两者中AMPK的靶向激活情况仍待后续研究和挖掘。抗骨质疏松中药的主要作用靶标为骨髓中BMSCs以及骨中成骨细胞和破骨细胞，能够充分发挥其多成分协同作用的优势；然而，各有效成分分别对于上述细胞分化、增殖以及凋亡作用的效果主次、大小、优劣等却鲜有衡量和评价标准，这方面也亟待日后深入研究。

总而言之，AMPK作为细胞的能量感受器，被靶向激活后既促进骨髓中BMSCs成骨分化抑制成脂分化，又促进骨中成骨细胞分化、抑制破骨细胞分化，在骨质疏松发病机制——骨代谢失衡中扮演重要角色，这为常见抗骨质疏松中药和活性成分以及筛选抗骨质疏松中药和活性成分均提供新靶点和研究目标，很有可能成为抗骨质疏松中药及活性成分研究的新方向。