大蒜提取物抑制饲料霉菌的应用研究

◆作者：董小英 林冰锦 周鹏 陈少珍 唐胜球

◆单位：韶关学院英东生物与农业学院

饲料霉变是困扰饲料业和畜牧业的一个难题。为增强畜牧业生产和人类饮食的安全性，在饲料中添加天然无毒、高效抗菌、无抗药性、加强免疫和经济实用型的饲料防霉剂已然成为饲料防霉的研究热点。研究表明，大蒜中含有抗菌成分，不仅能杀灭病原真菌，还能有效地抑制曲霉菌属的某些食物竞争性杂菌的生长繁殖。本研究通过研究大蒜提取物的最低抑菌浓度，高温高湿条件下大蒜提取物在饲料中的最佳添加量及最适pH值条件下大蒜提取物抑制霉菌的效果，探究饲料中添加大蒜提取物对饲料防霉的作用。通过上述研究，以期为大蒜提取物在饲料防霉中的应用，以及安全无毒、高效抑菌的天然防霉剂的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜大蒜（购于本地农贸市场）；试验饲料（主要含玉米粉、豆粕、花生饼、葡萄糖、鱼粉、碳酸钙、磷酸氢钙、蛋氨酸、赖氨酸、预混料等）；无水乙醇；察氏培养基；灭菌生理盐水；乳酸-乳酸钠缓冲液。

1.2 主要器材

恒温水浴锅、高压灭菌锅、离心机、玻璃三角瓶、移液管、若干培养皿、烧杯、试管与试管架、洗耳球等。

1.3 乙醇萃取法制取大蒜提取物

选取新鲜无破损的大蒜→剥皮洗净→准确称取100 g→捣成糊状→按照1∶1 的比例加入95%乙醇100 mL→室温萃取2h →3500 r/min 离 心 分 离20 min→取上清液→用微孔滤膜过滤→大蒜提取物。注意密封避光保存，建议放在冰箱内冷藏保存。

1.4 大蒜提取物的最低抑菌浓度（MIC）的测定

称取25 g 霉变饲料，溶解于250 mL 灭菌生理盐水，振荡加速溶解。取10-1稀释液10 mL 于一灭菌试管中，用洗耳球及移液管反复吹吸50 次，使霉菌孢子分散均匀。再用移液管吸取1 mL稀释液与9 mL 生理盐水混合均匀，重复以上稀释步骤，直到稀释倍数达到10-8，使霉菌量在显微镜下计数结果108个/mL 为宜，即1×108cfu/mL。

取6 支已灭菌的试管编号，采用试管二倍稀释法（韩文瑜等，1992）。依次在编号的试管中加入1.8 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、1 mL 的灭菌生理盐水，再用移液管吸取0.2 mL 的大蒜提取物加入到第1 支试管中，用洗耳球和移液管反复吹吸，使大蒜提取物与肉汤培养基充分混匀。再用移液管吸取1 mL 混合液至第2 支试管中，依次类推至第6 支试管，弃去最后吸取的1 mL 混合液。最后制成浓度分别为10%、5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%的大蒜提取物。

用移液枪吸取浓度稀释至1×108cfu/mL 的带菌液0.2 mL分别加入到上述6 支试管中，充分混匀后，各取1 mL 混合液注入提前经过灭菌处理的培养皿。然后在各培养皿中倒入溶化并冷却至50 ℃的察氏培养基15 mL。另吸取1 mL 95%乙醇和0.2 mL 稀释带菌液加入到空白培养基，作为对照。待各培养基冷却凝固后，倒置放入30 ℃恒温箱中培养，一周后进行霉菌总数的测定（GB 13092-91）。为减小误差，每个添加浓度重复3次，且每个实验重复3 次。

1.5 饲料强化防霉（破坏性试验）

首先取6 个提前经过干热灭菌的铝盒，分别加入1 kg 试验饲料。接着分别添加0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的大蒜提取物，混合均匀后，在第1～6 组中各添加水分为19%、18.5%、18%、17.5%、17%、16.5%，使饲料中的总水分量达到19%。半开盖，移至试验箱中（控制温度为30±2℃、湿度为90%±2%），培养观察15 d。为减小误差，每组设置3 个重复。每周数次取出试验饲料进行感官检验，参照表1 判断各组饲料的霉变情况，做好记录。观察过程中应尽量避免污染样品。

1.6 pH 对大蒜提取物防霉效果的影响

制备含菌平板：各取经过灭菌处理并冷却至50 ℃的察氏培养基15 mL 加入到灭菌培养皿，再用移液枪分别添加上述制备的霉菌孢子悬液1 mL，轻轻晃动使其混合均匀，待平面冷却凝固后倒置存放备用。严格无菌操作，防止杂菌污染。

使用乳酸- 乳酸钠缓冲液将大蒜提取物的pH 值分别调节至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。然后分别取不同pH 值的大蒜提取物3 mL 加入到5 个无菌试管中，依次做好标记后静置平衡10 h，再开始大蒜提取物的抑菌试验。用无菌镊子夹取提前经过灭菌处理的牛津杯，轻轻均匀垂直地放在上述制备的含菌平板上，每个培养皿中等间隔放入两个牛津杯。用移液管吸取0.15 mL pH 值相同的大蒜提取物加入到同一培养皿的牛津杯内，并做好标记。将各培养皿小心移至35 ℃恒温培养箱内培养24 h。上述试验，每个pH 水平设置平行试验3 皿，重复试验3 次。

2 结果与分析

2.1大蒜提取物最低抑菌浓度

由表2 可知，大蒜提取物的添加浓度与饲料霉菌的生长繁殖存在着关联性。当大蒜提取物浓度＜5%时，培养皿内仍可见霉菌。而当大蒜提取物浓度≥5%时，培养皿内肉眼观察无菌生长，呈透明状。由此可知，大蒜提取物对饲料霉菌的最低抑菌浓度为5%。

表1 饲料感官检验判定标准

表2 大蒜提取物的最低抑菌浓度测定

2.2 饲料破坏性试验结果

在饲料中添加0.5%～2.5%大蒜提取物，进行为期15d 的观察。结果显示，饲料中添加0.5%～1.5%大蒜提取物时，随着添加比例的递增，大蒜提取物的防霉效果逐渐加强。1.5%～2.5%大蒜提取物对饲料霉菌的抑制作用明显，但无明显差异(表3)。

此外，为了能够较为准确地预测出大蒜提取物的最适宜添加比例，基于上述实验结果，将大蒜提取物的添加比例细分为0、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%共6 组，每组设置3 个重复，在同等的试验条件下培养15d。分别在储存培养9d 和15d后进行取样，检测各处理组饲料中霉菌总数。由表4 可知，当大蒜提取物在饲料中的添加浓度为1.3%时，其防霉抑菌效果尤为显著。

表3 添加不同比例大蒜提取物的饲料的霉变情况

表4 各试验组霉菌总数和抑菌效果统计（X±SD，n=3）

图1 不同pH 条件下大蒜提取物的抑菌效果（cm）

2.3 pH 对大蒜提取物防霉效果的影响

由图1 可知，pH 在4.0～7.0之间的抑菌圈直径较大，明显大于pH=8.0 时的抑菌圈，说明在酸性条件下，大蒜提取物的抑菌效果较为显著。其中，当大蒜提取物的pH 值为6.0 时，试验组的抑菌效果明显优于其他pH 条件下的试验组。由此可知，大蒜提取物抑制饲料霉菌的最适宜pH 值为6.0。

3 讨论

大蒜提取物内含有多种硫醚，可通过与半胱氨酸结合反应、抑制巯基酶活性或脂类等物质的合成，实现对多种病原真菌以及食物病原性杂菌的抑制杀灭。研究表明，大蒜提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显的抗菌作用，大蒜提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 值分别为50 mg/mL 和25 mg/mL（郭永刚等，2008）。另一研究也证实，大蒜提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌有明显的抗菌效果，但对绿脓杆菌无抑制作用（何玉林等，2008）。大蒜的乙醇提取物的抑菌效果好过水提取物, 酸性的水溶液提取物效果最好, 可以较好地控制蜡样芽孢杆菌的生长。K-B 法进行体外抑菌活性的研究（穆可云等，2011）。在本试验中，大蒜提取物的防霉抑菌效果得到了有效证实，其抑制饲料霉菌的最低抑菌浓度为5%。

据相关文献可知，在高温高湿环境下储存的饲料易发生霉变。饲料被霉菌污染后，可引起多方面的危害如降低饲料营养价值，降低饲料适口性，影响动物繁殖性能，干扰动物免疫系统，并间接影响人的健康。有报道，饲料中添加0.95%～1.32%的大蒜汁可延长饲料霉变的时间。本试验参考其他学者的试验方法，采用95%乙醇浸提大蒜研磨液并浓缩制得大蒜提取物。通过对各试验组饲料的防霉效果进行比较，得到以下结果：当大蒜提取物的添加量在0.5%～1.5%时，其防霉效果与添加量呈正相关。采用饲料强化防霉（破坏性试验）法发现，恶化饲料储存环境（高温、高湿），加速饲料霉变，通过感官检验和霉菌总数的测定并证实，大蒜提取物在饲料中的最适宜添加水平是1.3%。

据了解，大多数防霉剂是以弱酸分子的形式穿过霉菌细胞膜而发挥作用的。所以随着基质（饲料）pH 值的递减，未解离的弱酸分子含量越多，防霉剂的作用效果逐渐增强。因此，促使饲料pH 值向酸性范围内转移，可有效提高防霉剂的防霉保鲜效果。本研究也证实，大蒜提取物在不同的pH 条件下的防霉效果有所区别，如pH 值趋于酸性范围时，大蒜提取物的防霉抑菌效果较显著；其中pH 值为6.0 时，大蒜提取物的防霉效果最佳。