青海湖裸鲤foxk1基因克隆和初步功能分析

闵倩雯， 张显波， 周其椿*， 李建光， 曾 圣， 陈飞雄， 杨 兴

(1.贵州省农业科学院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省特种水产工程技术中心， 贵州 贵阳 550025)

青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)属鲤形目，鲤科，裂腹鱼亚科，裸鲤属，俗称湟鱼、花鱼、狗鱼、无鳞鱼,为喜冷鱼类，分布于青海湖及其支流、克鲁克湖、扎陵湖及鄂陵湖，其肉质鲜嫩可口，是青海湖中唯一的经济鱼类。近年来由于自然和人为因素影响，青海湖裸鲤资源急剧下降，甚至面临衰竭的危险。贵州省冷水资源量巨大，水质良好，水温常年稳定在11～25℃，适宜养殖高品质冷水性鱼类。与北方冬季严寒期长，南方夏季水温偏高相比，贵州养殖冷水鱼普遍没有“半年养半年闲”的现象，十分适宜养殖青海湖裸鲤。贵州省农业科学院水产研究所前期从青海引进该品种进行养殖观察，该品种已完全适应贵州养殖环境。对青海湖裸鲤展开生殖生理学研究，对解析其性腺发育机制具有重要意义，为其接下来的人工扩繁和分子遗传育种研究奠定理论基础。

鱼类生殖生理受多个信号通路的共同调控，其中转录因子叉头框(Fox)家族成员对脊椎动物性腺发育过程必不可少。Fox家族的范围从FoxA到FoxS，包含100多种蛋白质[1]。所有的Fox蛋白都具有一个保守的DNA结合结构域，该结构具有带翼的螺旋结构，该结构由3个α螺旋和2个类似蝴蝶的翼组成[2]。Fox基因家族编码多个叉头蛋白，这些叉头蛋白表现出显著的功能多样性，并参与多种生物学过程。在哺乳动物中，叉头基因对于许多生物过程至关重要，包括发育、代谢过程、性别分化、繁殖和细胞周期调控等[1,3-5]。foxk1是Fox家族的成员之一，含有叉头关联结构域(forkhead-associated domain)，用于识别磷酸肽和DNA结合结构域，起到转录调控下游基因的作用[6-7]。foxk1依赖于其转录活性，介导广泛的生物过程。例如，foxk1通过与转录抑制复合物Sin3/Sds3相互作用激活肌源性祖细胞[8-9]；通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进细胞生长[10-11]；在重新编程细胞代谢以诱导有氧糖酵解中扮演重要的调节因子[12]；foxk1通过抑制53BP1定位于DNA损伤位点而负调控53BP1的功能，从而改变DSB诱导的以53BP1为中心的蛋白复合物，从而影响DNA修复的选择[13]。然而，foxk1在脊椎动物性腺发育过程中的功能和作用少见报道。因此，围绕青海湖裸鲤卵巢中的foxk1基因克隆和功能开展相关研究，为青海湖裸鲤的卵巢发育机制研究提供理论基础数据，以期对脊椎动物生殖生理学和繁殖生物学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

青海湖裸鲤从青海湖裸鲤救护中心引进，贵州省农业科学院水产研究所试验基地培育，于自然光周期下22℃恒温循环水系统中饲养。投喂汉业饲料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鲤foxk1基因克隆

根据GenBank中报道的相关物种的foxk1基因序列，在基因保守区域设计合成简并引物，用此简并引物进行foxk1部分基因片段扩增及测序，获取青海湖裸鲤foxk1基因中间部分序列，并通过5′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)和3′-RACE及与其它鱼类基因组序列比对获取foxk1基因全序列。

1.3 foxk1基因的系统进化分析

进化树包括人(human，Homosapiens)(NP_001032242.1)、小鼠(mouse，Musmusculus)(NP_951031.2)、鸡(chicken，Gallusgallus)(XP_015149844.1)、蜥蜴(lizard，Zootocavivipara)(XP_034986413.1)、金线鲃(golden-linebarbel，Sinocyclocheilus grahami)(XP_016122830.1)、金鱼(goldfish，Carassiusauratus)(XP_026057237.1)、鲤鱼(common carp，Cyprinuscarpio)(XP_018923732.1)、斑马鱼(zebrafish，Daniorerio)(NP_956196.1)、斑点雀鳝(spotted gar，Lepisosteusoculatus)(XP_006637172.1)和研究克隆的青海湖裸鲤foxk1氨基酸序列。进化树以NJ法采用MEGA 6.0构建。斑马鱼foxk2(NP_001184186.1)氨基酸序列作为外类群。进化树中数值表示这一分支的可靠程度。

1.4 脊椎动物foxk1基因共线性分析

脊椎动物foxk1基因及其相邻基因图谱的构建分析在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)网页上进行。

1.5 青海湖裸鲤foxk1组织表达模式分析

通过RT-PCR技术分析青海湖裸鲤foxk1在成鱼各个组织中的表达情况。解剖24月龄青海湖裸鲤，取其脑、垂体、鳃、心脏、肝脏、肠、脾脏、头肾、性腺、肌肉和肾脏放于液氮速冻。按照RNAiso Plus操作说明提取总RNA，DNase I处理，逆转录合成cDNA，用基因特异引物进行扩增，检验foxk1在各个组织中的分布情况。以青海湖裸鲤β-actin作为内参。以卵巢cDNA模板为阳性对照，以双蒸水模板为阴性对照。

1.6 青海湖裸鲤foxk1基因在各时期卵巢中的表达情况

取3、6、9、12、18、24月龄青海湖裸鲤卵巢液氮速冻，提取总RNA，合成cDNA。采用Real-time PCR检测foxk1基因在各时期青海湖裸鲤卵巢中的表达情况。管家基因β-actin作为内参，目标基因mRNA的相对表达水平采用公式R= 2-△△Ct方法计算[14]。结果表示为Ct值的平均值±标准偏差，采用SPSS进行显著性分析，组间差异采用单因素方差(one-way ANOVA)分析Duncan's post-hoc检验，显著性水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 青海湖裸鲤foxk1 cDNA和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析显示，青海湖裸鲤foxk1全长cDNA序列为2 251 bp，包括5′端79 bp的非编码区，1 944 bp的蛋白质编码区和3′端228 bp非编码区；开放阅读框编码647个氨基酸(图1)。

2.2 脊椎动物foxk1序列对比和系统聚类

通过氨基酸序列的比对，foxk1在脊椎动物间有高度相似性，含有forkhead associated domain和Forkhead domain结构域；克隆的青海湖裸鲤foxk1与人、小鼠、鸡、蜥蜴、斑点雀鳝、金线鲃、金鱼、鲤鱼、斑马鱼foxk1间的氨基酸序列相似性分别为68.2%、69.3%、76.8%、69.6%、82.8%、94.4%、93.2%、94.1%、93.4%(图2)。

系统进化树分析显示，人、小鼠、鸡、蜥蜴的Foxk1氨基酸序列聚为一支，鱼类斑点雀鳝、金鱼、鲤鱼、斑马鱼、金线鲃、青海湖裸鲤的Foxk1氨基酸序列聚为一支(图3)。

2.3 脊椎动物foxk1基因共线性

共线性分析显示，foxk1与其邻近基因gnal2、cardl1、sdk1、ap5z1、radil、mmd2在人、小鼠、鸡和龟中的共线性高度保守，腔棘鱼的gnal2、cardl1、sdk1、mmd2不共线；鱼类中，除斑马鱼外，foxk1与其邻近基因gnal2、sdk1、radil、mmd2高度保守；4足类和鱼类只有gnal2、sdk1、mmd2和foxk1的共线性保守(图4)。

2.4 青海湖裸鲤foxk1组织表达模式

从图5可知，foxk1高表达于雌雄个体的垂体和性腺，中量表达于雌雄个体脑，微量表达于雌雄个体鳃和心脏。

2.5 青海湖裸鲤foxk1在卵巢不同发育阶段的表达

从图6看出，经Real-time PCR分析，foxk1在3、6、9、12、18、24月龄卵巢中都存在表达，在3月龄和6月龄表达量最低，9月龄持续显著升高，后期持续高表达。

3 结论与讨论

成功克隆的青海湖裸鲤foxk1基因，含有forkhead associated domain和Forkhead domain结构域；系统进化树分析显示，以斑马鱼Foxk2作为外类群，克隆的foxk1与其它脊椎动物的foxk1聚为一支，且克隆的foxk1与其它脊椎动物的foxk1序列同源性最低为68.2%，最高达94.4%；共线性分析显示，4足类foxk1基因及相邻基因相当保守；鱼类的foxk1基因及相邻基因的共线性十分保守，斑马鱼的不保守型也可能是由于测序拼接不完整造成。

foxk1作为转录因子，在生物的多种信号通路和器官发育中起重要作用。研究结果显示，foxk1在检测的青海湖裸鲤的多个组织中有表达，说明该基因的功能是多元化的。foxk1在3月和6月卵巢中低表达，在9月及后期卵巢中高表达，说明foxk1主要在卵巢卵母细胞发育和成熟过程中起作用。在大鲵中的研究显示，foxk1在卵巢中也存在高表达，且存在温度依赖性，相对于20℃和28℃，在24℃饲养的大鲵卵巢中foxk1表达最高[15]。foxk1参与脊椎动物卵巢发育，但其具体功能和作用机制还有待进一步研究。