上海市公共卫生临床中心2015—2019年乙型肝炎病毒基因突变分析

张莉 孟现民 董平

中国约有7 000万乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染者，2 000万～3 000万慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者[1]。乙肝防控工作形势严峻，对有抗病毒指征的患者进行及时、有效的治疗以避免疾病进展十分重要[2]。核苷(酸)类似物(nucleoside/nucleotide analogues，NAs)难以彻底清除HBV，需长期使用[3]，前期大量使用低耐药屏障药物继发耐药使后续治疗变得棘手，掌握HBV耐药情况可以指导合理用药[4]。本研究通过对上海市公共卫生临床中心的HBV基因检测结果进行分析，获得HBV耐药突变位点分布情况以及对各种NAs的耐药率，并进一步探析了HBV耐药的影响因素。

资料与方法

一、研究方法

选取我院2015年—2019年诊断为CHB且送检HBV基因检测的患者，对HBV RT区的I169、V173、L180、A181、T184、A194、S202、M204、N236、M250共10个位点的突变情况进行统计，并计算同期内NAs的消耗频度及其占比。对2019年开展基因检测的患者，录入性别、年龄、HBV DNA、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、HBV血清标志物以及HBV基因型，剔除合并HCV、HIV、HBV DNA <500拷贝/mL或<100 IU/mL以及检测结果不完整的患者，探析HBV耐药突变的影响因素。

二、统计学方法

采用统计软件SPSS 23.0对数据进行分析，以四分位数M(QL，QV)表示不符合正态分布的计量资料，组间差异采用曼-惠特尼检验；计数资料以率(%)表示，组间差异采用皮尔逊卡方或费希尔精确检验。多因素分析采用二元logistics回归分析。P<0.05认为有显著性差异。

结 果

一、 HBV基因检测结果

2015年—2019年共有4 182例次CHB患者进行了乙肝基因检测，男性2 937例，女性1 245例；年龄41(32,54)岁；发生突变651例，突变率15.57%；突变率从2017年开始下降，2019年降至7.70%，详见表1。我院用于CHB治疗的NAs以恩替卡韦(占43.07%)为主，其次是阿德福韦(占27.35%)，高效低耐药品种恩替卡韦、替诺福韦的使用占比逐年升高，拉米夫定、阿德福韦以及替比夫定的使用占比逐年减少。本研究纳入的10个位点突变率分别为rtM204 13.46%(563例)、rt L180 8.18%(342例)、rtA181 1.79%(75例)、rtV17 30.88%(37例)、rtN236 0.57%(24例)、rtS202 0.12%(5例)、rtM250 0.10%(4例)、rtT184 0.10%(4例)、rtI169 0.02%(1例)。

表1 2015年—2019年HBV基因突变及NAs占比情况

651例CHB患者的HBV基因突变以32种模式呈现，突变模式多样。其中287例患者为单位点突变，有6种模式；324例患者为双位点突变，有14种模式；36例患者有3个位点突变，有10种模式；1例患者有4个位点突变。详细的基因突变情况见表2。

二、 HBV的基因突变的耐药解读

本研究32种突变模式中有28种可导致耐药。涉及拉米夫定耐药的模式有27种，630例，耐药率15.06%；涉及阿德福韦酯耐药的模式有13种，89例，耐药率2.13%；涉及恩替卡韦耐药的模式有6种，9例，耐药率0.22%。剩余4种突变类型中，L180M为单纯的补偿突变，不直接导致耐药；I169L和M250L+N236V为恩替卡韦耐药的联合突变位点，暂不明确其在不伴M204联合L180突变时的意义，但是需要关注此类突变对恩替卡韦的敏感性改变；N236V为阿德福韦的非经典突变，需要关注其对阿德福韦以及替诺福韦的敏感性改变；M204S+L180M为拉米夫定的非经典突变，需要关注其对拉米夫定和恩替卡韦的耐药可能[4-7]。

557例为HBV单耐药，拉米夫定单耐药545例(占85.02%)，阿德福韦单耐药12例(占1.87%)；73例双重耐药，拉米夫定、阿德福韦双重耐药65例(占10.14%)，拉米夫定、恩替卡韦双重耐药8例(占1.25%)；1例(占0.16%)同时对拉米夫定、阿德福韦与恩替卡韦呈现三重耐药。

三、 HBV耐药的影响因素分析

2019年符合要求的患者有323例，其中耐药47例(14.55%)，不耐药276例(85.45%)，男性210例(65.94%)，女性113例(34.06%)，年龄 41(32，54)岁，B基因型104例(32.20%)，C基因型219例(67.80%)。

(一)影响HBV耐药的单因素分析 将患者年龄、性别、基因型、HBV DNA(统计时取对数)、ALT、AST、HBV血清标志物检测结果对耐药的影响进行单因素分析，结果显示年龄、基因型、ALT、AST、HBeAg、HBeAb对突变有影响(P<0.05)，性别、HBV DNA、HBsAg、HBsAb以及HBcAb对耐药没有影响(P>0.05)，详见表3。

(二) HBV耐药影响的多因素分析 将患者年龄、基因型、HBV DNA、ALT、AST、HBeAg、HBeAb对耐药的影响进行多因素logistics回归分析，结果显示、基因型、HBV DNA、ALT、AST、HBeAg与耐药不相关，年龄和HBeAb与耐药相关，年龄越大、HBeAb阴性的CHB患者更加容易发生耐药，详见表5。

表2 HBV 基因突变模式

表3 HBV突变的影响因素分析

讨 论

HBV是一种高变异病毒，不仅在慢性持续感染中可以发生自然变异，还可因暴露于抗病毒药物诱导变异，进而导致其对抗病毒药物产生耐药，因此HBV的耐药问题值得关注[3, 8]。本研究结果显示，2015年-2019年上海市CHB患者的HBV基因突变率15.57%，与Guo Xianghua等[9]报道的中国北方35.31%以及Zhang Hongyu等[10]报道的江苏30.8%相比明显较低，与普冬等[11]报道的昆明10.1%相比偏高，考虑与各地报道的年份不同有关，中国的HBV耐药率比土耳其46.86%普遍较低[12]。2009年-2016年期间，中国北方的HBV的耐药率逐年下降[9]，江苏地区的耐药率逐年升高[10]，本研究显示上海市HBV耐药率逐年下降，2019年降至7.7%，结合我院的NAs应用情况，考虑耐药率降低与高耐药屏障药物恩替卡韦、替诺福韦和丙酚替诺福韦的使用占比逐年增加有关[13-14]。

本研究检测的HBV位点突变率以rtM204(13.46%)最高，其次为rtL180(8.18%)和rtA181(1.79%)。最多见的突变模式为rtM204I单位点突变，占所有突变例数的32.41%，其次为rtM204V+ rtL180M和rtM204I +rtL180M，分别占29.34%和16.43%；rt M204突变主要引起左旋核苷类耐药，也是恩替卡韦耐药的联合突变位点，rtL180与rtM204联合突变后，只需再突变1个位点(rtI169或rtT184或 rtS202或 rtM250)，就能引起恩替卡韦耐药[4, 6]。上海市HBV对拉米夫定耐药率15.06%最高，其次是阿德福韦2.13%和恩替卡韦0.22%，与其他研究[9]报道的27.23%、9.67%和3.69%相比均较低，考虑与抽样时间不同有关。值得关注的是，本研究中恩替卡韦耐药率虽只有0.22%，但rtM204与rtL180联合突变率达7.13%，加上恩替卡韦的使用占主导且逐年增加，未来需高度警惕HBV对恩替卡韦耐药突变率升高的可能[15]。指南[1]将至少对2种不同类别NAs耐药定义为多重耐药，本研究中HBV多重耐药发生率1.77%(74例)，与Zhang等[10]报道的7.45%相比较低。替诺福韦从2015年开始用于治疗CHB，截至2019年没有发生替诺福韦耐药的情况，提示替诺福韦治疗CHB五年内出现耐药的概率较小[16 ]。

本研究对HBV耐药的影响进行单因素分析，发现年龄、基因型、ALT、AST、HBeAg和HBeAb与耐药有关；进一步对HBV耐药的影响进行多因素分析，发现年龄和HBeAb阴性是导致HBV耐药的危险因素。随着患者年龄增长，HBV发生耐药的风险升高。这与我国现有的CHB患者的HBV感染多源于婴幼儿时期的母婴垂直传播和儿童间水平传播有关[1, 7]，年龄越大，HBV感染时间越长，长时间慢性感染HBV病毒复制未得到有效抑制，更容易发生耐药突变。另外，HBeAb阴性的患者发生HBV突变的概率是HBeAb阳性患者的9.423倍，提示临床需重视HBeAg阴性CHB患者的耐药情况，必要时及时进行基因突变检测。

上海市HBV耐药率逐年下降，突变模式多样，尤以拉米夫定耐药最常见，拉米夫定和阿德福韦双重耐药也有发生。对治疗效果不佳的患者，建议及时送检HBV基因检测，换用替诺福韦酯或丙酚替诺福韦酯，并加强对HBV DNA以及血生化指标的监测。对于正在应用非首选药物治疗的患者，也建议换用强效低耐药品种。未来需要加强监测HBV对恩替卡韦耐药的情况。