黄荆子中一个木脂素成分的分离与NMR解析

王志尧， 韩红园， 王 韬， 陈 欣， 张海艳， 常 霞

（1.河南省科学院天然产物重点实验室，郑州 450002； 2.河南省生物技术开发中心，郑州 450002）

黄荆属于被子植物，是马鞭草科的牡荆属植物，分布在中国的许多省市. 其果实、叶、枝、根均可入药，性温，味辛、苦，具有清热解表、利湿排毒、通经活络的功效. 据《本草纲目》、《唐本草》、瑶医“老班药”下的“七十二风”药印度医学阿育吠陀中记载，黄荆可用来治疗风湿病、类风湿性关节炎［1-2］. 具有广泛的抗癌活性［3-6］，对人乳腺癌（MCF-7、MDA-MB-4355、T47D）［7-10］，卵巢癌（COCI）［11-13］，结肠癌（HT-29）［14］，人肝癌（SMMC-7721、HepG2）［15-16］，人宫颈癌（HeLa）［17-19］，人绒毛膜癌（JEG-3）［20-22］等细胞株有显著的抑制增殖作用. 木脂素类化合物因为具有抗炎、解热镇痛、免疫增强、抗氧化作用，是黄荆发挥抗风湿类湿及抗癌作用的重要化学成分［23-25］. 为了更深一步研究黄荆子中抗风湿类风湿和癌症的活性成分组及其作用机制，我们研究了从黄荆子分离纯化vitecannasides B 的工艺，并最终通过DEPT、HSQC、HMBC、1H-1H COSY、NOESY等1D和2D NMR波谱技术对vitcannasides B的13C、1H NMR图谱进行详细NMR解析，特别是化合物上葡萄糖基团的准确解析未见报道，为下一步开发抗风湿、抗癌复方新药奠定基础，详细报道如图1所示.

图1 Vitecannasides B的结构式Fig.1 Structure of vitecannasides B

1 实验

1.1 黄荆子样品前处理

取未粉碎黄荆种子5 kg，粉碎，用3倍量75%的乙醇70 ℃加热回流提取3次，合并三次提取液65 ℃减压回收溶剂得浸膏460 g.

1.2 黄荆子浸膏聚酰胺柱层析分析

1.2.1 样品预处理 将第一步所得浸膏用30～60目的聚酰胺拌样（拌样量为m（浸膏）∶m（聚酰胺）=0.5∶1），置50 ℃水浴锅上干燥至粉末状.

1.2.2 聚酰胺填料的预处理 称取2.25 kg的聚酰胺粉末（30～60目）取95%的工业级乙醇10 L，煮沸1 h，冷却.

1.2.3 装柱 取高58 cm，内直径15 cm的分离柱一根，湿法装柱. 用蒸馏水冲到无醇味，然后加入处理好的样品，经测量，样品层厚度6 cm.

1.2.4 柱层析过程 流动相为水→95%乙醇，具体流动次序如下：

水（50 L）→35%乙醇（60 L）→50%乙醇（60 L）→75%乙醇（60 L）→95%乙醇（60 L），分别收集以上各流出液，通过多功能提取浓缩罐→大旋转蒸发仪（60 ℃）→小旋转蒸发仪（54 ℃）三级浓缩得到5个样品，分别标记为A-1（水），A-2（35%乙醇），A-3（50%乙醇），A-4（75%乙醇），A-5（95%乙醇）.

1.3 聚酰胺柱分离5个样品高效液相分析

使用高效液相仪器对浸膏和聚酰胺柱分离出的5 个样品进行分析（分析参数：仪器名称Aglient1260；检测器DAD；流动相为乙腈和水，流动次序为10%乙腈～100%乙腈，冲柱30 min→10%乙腈冲柱5 min；流速1 mL/min）. 由以上6个图谱分析所得水部位多为极性大的成分，其他波份段的成分有重叠；A-2、A-3部位紫外吸收较强且绿色荧光较明显，可能含有木脂素、黄铜类成分较多. 因此，着重对A-2、A-3 部位进行分析. 样品A-3减压浓缩后得浸膏35 g，硅胶（100～200目）30 g拌样并干燥后，上样于硅胶（200～300目）300 g柱，以石油醚-丙酮溶剂系统（8∶1→4∶1→2∶1→1∶1→1∶2→1∶4→0∶1），进行中压制备柱层析，150 mL收集一个流分，所得各流份进行TLC 分析，合并相同流份，得到13个流份（Fr.1～Fr.13），流份Fr.3、Fr.5放置析晶，分别进行重结晶后，得到化合物1（100 mg）.

2 仪器

所有NMR 实验均在Bruker DPX 400 型核磁共振仪上进行，1H NMR 的工作频率为400 Hz，13C NMR 的工作频率为100.577 MHz，以DMSO-d6为测试溶剂，使用5 mm NMR探头. 分析用Agilent 1260系列高效液相色谱仪；中压制备色谱仪为天津博纳艾杰尔中压快速纯化制备系统，型号FS-82000s. 聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品）、柱层析用硅胶（100～200 目和200～300 目）为青岛海洋化工厂产品；色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18（Agilent，4.6 cm×150 cm，1 mL/min；9.4 mm×250 mm，2 mL/min）；薄层层析（TLC）：薄层层析硅胶GF254薄层预制板为青岛海洋化工厂产品，显色剂为5%的H2SO4乙醇溶液，喷洒后加热显色.

3 试药

黄荆种子购自安徽省亳州药材市场，标本保存于河南省科学院天然产物重点实验室.

4 结果与讨论

化合物1为黄色透明油状物（甲醇），其13C NMR数据显示26条碳峰信号，DEPT显示，2个伯碳：δC55.26、54.99；2 个仲碳：δC69.42、61.38；14 个叔碳：δC193.14、148.54、119.67、117.25、114.51、112.42、111.02、104.16、76.58、76.52、73.86、70.20、42.60、39.98；8 个季碳：δC150.51、147.27、147.15、144.45、135.78、134.06、133.47、123.21.

根据碳化学位移规律，其中的2个伯碳均为甲氧基（δC55.26、54.99）；2个仲碳为连氧碳（δC69.42、61.38），应归属C-3α、C-6″；14 个叔碳中，有2 个一般脂肪碳（δC42.60、39.98），1 个糖的端基碳（δC104.16）归属于C-1″，6 个双键碳（δC148.54、119.67、117.25、114.51、112.42、111.02），1 个醛基碳（δC193.14）归属于C-2α，4 个环状单糖上叔碳（δC76.58、76.52、73.86、70.20）；8个季碳信号全部为双键碳（δC150.51、147.27、147.15、144.45、135.78、134.06、133.47、123.21）. 综合分析，化合物1为一个单糖氧苷类化合物.

HSQC 指出，δC69.42（C-3α）与δH3.72（1H，dd，J=10.0，4.0 Hz）、3.20（2H，m）相关，表明δH3.72、3.20（其中1 个氢）分别归属于H-3α（a）、3α（b）.1H-1H COSY 指出，δH3.72［H-3α（a）］、3.20［H-3α（b）］均与δH3.35（1H，m）相关，加之δC39.98（叔碳）与δH3.35 HSQC 相关，表明δH3.35归属于H-3，δC39.98归属于C-3；δH3.35（H-3）与δH4.42（1H，brs）相关，加之δC42.60（叔碳）与δH4.42 HSQC 相关，表明δC42.60、δH4.42 分别归属于C-4、H-4. δC193.14（C-2α）与δH9.39（1H，s）HSQC相关，表明δH9.39归属H-2α.

HMBC指出，δC193.14（C-2α）、39.98（C-3）与δH7.46（1H，brs）相关，加之δC148.54（叔碳）与δH7.46 HSQC相关，表明δH7.46归属H-1，δC148.54归属于C-1；δC134.06（季碳）与δH9.39（H-2α）、4.42（H-4）、3.35（H-3）相关，表明δC134.06 归属C-2；δC112.42（叔碳）与δH7.46（H-1）相关，δC148.54（C-1）与δH7.04（1H，s）相关，加之δC112.42（叔碳）与δH7.04 HSQC 相关，表明δH7.04 归属于H-8，δC112.42 归属于C-8；δC133.47（季碳）与δH7.46（H-1）、7.04（H-8）、4.42（H-4）、3.35（H-3）相关，表明δC133.47 归属于C-10；δC123.21（季碳）与δH7.46（H-1）、6.70（1H，brs）、4.42（H-4）相关，表明δC123.21归属C-9，δH6.70归属H-5；δC117.25（叔碳）与δH4.42（H-4）相关，同时δC117.25与δH6.70（H-5）HSQC相关，表明δC117.25归属于C-5；δC147.27（季碳）与δH7.04（H-8）、6.70（H-5）相关，δC150.51（季碳）与δH6.70（H-5）、3.68（3H，s）相关，加之δC55.67（甲氧基）与δH3.68（3H，s）HSQC 相关，表明δC147.27、150.51 归属于C-6、C-7，且δC150.51 的碳上还有甲氧基（δH3.68）取代，但C-6、C-7的归属区分需进一步确定. NOESY指出，δH7.04（H-8）与3.68相关，表明δH3.68应连接在C-7上，故δC150.51归属于C-7，147.27归属于C-6.

根据氢化学位移规律和偶合分裂情况，δH6.54（1H，d，J=8.0 Hz）、6.32（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz）、6.59（1H，d，J=2.0 Hz）分别归属于H-5′、H-6′、H-2′，加之δC114.51（叔碳）/δH6.54、119.67（叔碳）/6.32、111.02（叔碳）/6.59 HSQC相关，表明δC114.51、119.67、111.02分别归属于C-5′、C-6′、C-2′. HMBC指出，δC135.78（季碳）与δH6.54（H-5′）、4.42（H-4）、3.35（H-3）相关，表明δC135.78 归属于C-1′；δC144.45（季碳）与δH6.59（H-2′）、6.54（H-5′）、6.32（H-6′）相关，表明δC144.45 归属于C-4′；δC147.15（季碳）与δH6.59（H-2′）、6.54（H-5′）、3.86（3H，s）相关，同时δC55.26（伯碳）与δH3.86（3H，s）HSQC相关，表明δC147.15归属于C-3′，δH3.86、δC55.26分别为连接在3′位上的甲氧基氢、碳信号.

糖部分的归属主要是依靠1H-1H COSY、HSQC、HMBC 等2D NMR 技术解析的.1H-1H COSY 指出，δH4.19（1H，d，J=7.7 Hz）与δH3.24（1H，m）相关，同时δH4.19与δC104.16（C-1″）HSQC相关，δH3.24与δC73.86（叔碳）HSQC 相关，表明δH4.19、3.24 分别归属于H-1″、H-2″，δC73.86 归属C-2″. 同时δC61.38（C-6″）与δH3.80（1H，dd，J=12.0 Hz）、3.63（1H，dd，J=12.0，7.0 Hz）HSQC 相关，表明δH3.80、3.63 分别归属于H-6″a、H-6″b.1H-1H COSY 指出，δH3.80（H-6″a）与3.63（H-6″b）、3.20（2H，m）相关，加之δC76.52（叔碳）与δH3.20 HSQC 相关，表明δC76.52 归属于C-5″，δH3.20（其中1 个氢）归属于H-5″. 另外，δC76.52（C-5″）与δH3.29（1H，m）HMBC 相关，加之δC70.20（叔碳）与3.29 HSQC 相关，表明δH3.29、δC70.20 分别归属于H-4″、C-4″. 剩下的δH3.35（2H，m）其中1 个氢应归属于H-3″. HSQC 指出，δC76.58（叔碳）与δH3.35（H-3″）相关，故δC76.58归属于C-3″. 根据H-1″在1H NMR谱中的偶合常数为7.7 Hz，提示该端基质子和C-2″位质子均为竖键，二面夹角约为180°，表明该六碳吡喃单糖基团为β-D 构型［26］. 该β-D 六碳吡喃单糖基团的1H及13C NMR图谱数据与文献［27］报道的vitecannasides B 的β-D葡萄糖基团的数据一致，故糖基为β-D葡萄糖基团.

NOESY指出，δH4.42（H-4）与δH3.72［H-3α（a）］、3.20［H-3α（b）］相关，表明H-3α与H-4处于环的同一侧.1H NMR 图谱显示H-4 的信号为宽单峰，推断其与H-3 偶合较小，说明这两个氢的双面夹角接近90°，也进一步说明H-4 与H-3 在环的两侧. 由此，化合物1 为6-Hydroxy-4-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-3-hydroxymethyl-7-methoxy-3，4-dihydro-2-naphthal-dehyde-3α-β-D-glucopyranoside（见图1），其1D 及2D NMR 详细解析数据见表1. 以上光谱数据与文献［27］报道的vitecannasides B 一致，故鉴定化合物1为vitecannasides B.

表1 Vitecannasides B的NMR数据（CD3OD，400 MHz/H）Tab.1 NMR data of vitecannasides B（CD3OD，400 MHz/H）

续表

致谢：郑州大学分析测试中心的朱卫国及康建勋两位老师帮助进行核磁共振仪样品测试，河南省科学院天然产物重点实验室的赵天增研究员对样品核磁共振图谱数据解析方面给予指导，在此特致谢意！