高温胁迫下叶用莴苣形态变化及茎尖显微结构分析

黄 倩，唐汉程，郝新迪，许梦男，刘超杰，范双喜，韩莹琰

(北京农学院 植物科学技术学院，北京 102206)

叶用莴苣(LactucasativeL.)菊科莴苣属[1]，以生食为主，亦可炒食或煮制[2]，经常食用可以补充蛋白、甘露醇、莴苣素等多种有机物，同时富含维生素A、维生素C及钙、铁、磷等多种微量元素，具有清热利尿、扩张血管、辅助治疗高血压等疾病的效用[3]。叶用莴苣性喜冷凉，不耐炎热，生长适宜温度在15～20 ℃之间[4]，生长温度超过30 ℃时易先期抽薹，促使花芽分化。分化的花芽自莲座叶中抽出从而使植株开始长高，导致叶片数量减少[5]，大大降低产量，叶片苦味增加的同时导致品质和商用价值的下降[6]。Diamante等[7]研究发现对叶用莴苣进行降温处理能抑制抽薹；严妍[8]得出夜温15 ℃有利于叶用莴苣口感和营养品质的提高并且延迟抽薹。作物耐高温抽薹的研究主要集中在“低温春化型蔬菜”，对于不同温度处理下叶用莴苣前期高温抽薹的研究鲜见报道。本研究对叶用莴苣不同温度处理下形态及茎尖生长点变化进行分析，确定叶用莴苣高温处理下抽薹时间。

石蜡切片技术是现今进行组织解剖学研究中运用最广泛的试验技术之一，也是研究植物器官及组织细胞的有效手段[9]。石蜡切片具有技术成本低、操作简单等特点，使其广泛应用于分子生物学、植物解剖学等领域[10-11]。石蜡切片与扫描电镜等仪器的结合，使植物解剖学的研究从单一的观察微观结构扩增到成分的定性分析，现今又到定量测量，运用石蜡切片技术分析植物的抽薹机制，更直接揭示植物的耐受机理[12]。石蜡与植物细胞组织有很好的结合性，经过样本采集、固定、脱水、浸蜡、包埋等一系列操作制作出切片，组织完整、厚薄均匀及染色清晰的切片才是效果好的石蜡切片。在制片过程中每一个环节都直接影响切片的质量，根据不同植物设定不同的固定和染色时间至关重要。在前人的不断改进中，石蜡切片的环节和质量渐趋完善[13]，切片流程针对不同材料做出调整[14]，Wills等[15]、Argall等[16]对石蜡切片的透明步骤做出改进，用histolene代替二甲苯，大大降低操作过程中二甲苯对操作人员的伤害。本试验运用石蜡切片技术对叶用莴苣茎尖生长点的特殊状态进行观察，为叶用莴苣高温抽薹的研究提供技术支持。

随着全球气候变暖，温度逐步升高，叶用莴苣在自然状态下的生长环境堪忧。叶用莴苣高温下极易先期抽薹的生长特性，使得自然环境下种植叶用莴苣受到季节和环境温度的限制进而导致产量和品质的降低。明确叶用莴苣高温胁迫下抽薹时间，观察形态结构变化，对于叶用莴苣的推广和生产具有重要意义。

本试验旨在通过设置不同温度的生长环境，观察叶用莴苣热敏‘s39’的外形表观特征，测量茎长，并运用石蜡切片技术揭示茎尖分生组织显微结构，分析得出‘s39’品种对高温环境的耐受性。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为叶用莴苣‘s39’，北京农学院植物科学技术学院蔬菜优质安全栽培技术实验室保存。

1.2 材料处理

选取颗粒饱满的新鲜种子，均匀播种在垫有滤纸的培养皿中，倒入适量水分，于22 ℃人工气候室催芽24 h，选取长势一致的健康幼苗，用镊子夹入含有混合基质(草炭∶蛭石∶珍珠岩=3∶2∶1)的穴盘中，在人工气候室生长，21 d定植于花盆中，缓苗9 d进行处理。对照组：6：00至20：00为22 ℃，20：00至次日6：00为17 ℃，光照强度12 000 lx，光照时间16 h/d，相对湿度为60%；高温组：6：00至20：00为35 ℃，20：00至次日6：00为25 ℃，光照与相对湿度不变，时间为9 d。每组种植20株，各组生长环境保持一致。选取3、5、7、9 d植株取样，观察形态特征并测量茎长，茎尖取下放入配制好的3.7% FAA固定液中，4 ℃保存。

1.3 表观特征、茎长测量

先分别观察叶用莴苣植株在25 ℃和35 ℃处理下(第3天、第5天、第7天、第9天)的形态变化以及长势状况。然后25 ℃和35 ℃处理下3、5、7、9 d植株取3株，整株取下，根部切掉，清水洗净，用测量尺测量植株茎部，获得数据用SPSS17.0进行方差分析。

1.4 叶用莴苣茎尖生长点石蜡切片观察

(1)固定：将植株茎尖用镊子轻轻剥出，刀片切下，尽量切去多余组织，迅速放入3.7% FAA固定液固定24 h以上。

(2)脱水：用50%、70%、80%、95%、100%、100%乙醇对材料逐级脱水，逐级脱水时间为30、30、30、30、15、15 min。

(3)透明：将脱水后的材料放入离心管中，依次加入50%二甲苯/50%乙醇溶液、纯二甲苯、纯二甲苯，分别处理1.0、0.5、0.5 h。

(4)浸蜡：在最后一次处理后加入切碎的石蜡碎屑(越细越好，少量多次)至饱和，于42 ℃恒温箱内过夜。

(5)换蜡：将(4)中二甲苯倒掉，恒温箱调至60 ℃使二甲苯蒸发1 h，加入融化的新蜡，4.5 h内换纯蜡2次(每隔1.5 h换纯蜡1次)。

(6)包埋：准备好纸盒、镊子以及融化的蜡，将纸盒摆放好，倒入二分之一融化的蜡，用酒精灯烧过的镊子夹出茎尖，调整好位置，等待冷却成块即可。

(7)修片与切片：将包埋好的蜡块修成凸状，尽量使各平面保持平整，将带有茎尖的部分凸出，用小刀在酒精灯上烧热，轻触蜡片底部，然后迅速移至小木块上粘住。调整刀片与石蜡的角度约为15°，切片厚度10～15 μm。

(8)展片：准备一个干净的方形水缸，倒入加热至45 ℃左右的纯水，将切好的蜡带轻轻放入水中展开，用载玻片捞出，吸水纸吸干水分，放置在40 ℃烘片机上烘干，后置于37 ℃恒温箱内过夜。

(9)脱蜡染色：二甲苯10 min，二甲苯10 min，50%二甲苯/50%乙醇溶液15 min，100%乙醇5 min，100%乙醇5 min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，70%乙醇5 min，50%乙醇5 min，30%乙醇5 min，去离子水5 min。1%甲苯胺蓝溶液10 min，蒸馏水10 min，100%酒精2 min，1∶1二甲苯∶乙醇1 min，二甲苯1 min。

(10)封片：在切片上滴1滴中性树胶，用盖玻片盖住。

(11)荧光正置显微镜观察照相。

2 结果与分析

2.1 不同温度处理下叶用莴苣表观特征观察

35 ℃高温处理下7 d开始抽薹，25 ℃处理下均未出现抽薹现象，见图1。25 ℃处理下植株总体长势较好，叶片肥大呈浅绿色，叶片数较多。35 ℃高温处理下3 d、5 d时长势良好，叶片翠绿，与25 ℃处理相比基本没有区别；第7天时植株茎伸长开始发生抽薹现象，与25 ℃处理相比，植株长势稍弱，叶片开始变小，颜色变紫；第9天时植株茎伸长，整体长势弱，叶片稀疏、弱小，顶端叶片开始呈现黄绿色，而此时25 ℃对照组长势较好，叶片宽大呈翠绿色。35 ℃高温胁迫下叶用莴苣容易发生提前抽薹现象，长势变弱。

注：A-D分别为25 ℃处理3、5、7、9 d植株，E-H分别为35 ℃处理3、5、7、9 d植株

2.2 不同温度处理下叶用莴苣茎长变化

为了能够直观准确观察不同处理下叶用莴苣‘s39’抽薹前后茎长变化，明确高温对叶用莴苣茎长的影响。分别取35 ℃、25 ℃处理下3、5、7、9 d茎部，每个时期处理选取3株重复，测量茎长，结果见图2。25 ℃处理下，3、5、7、9 d植株茎的长度增高幅度不大，基本保持在同一水平，均在2～3 cm之间，无显著变化。35 ℃处理时3 d和 5 d叶用莴苣植株茎的长度变化不大，总体呈现升高趋势，第7天茎长明显增加，为25 ℃常温对照组的1.57倍，差异显著。第9天茎持续伸长，达到了25 ℃常温对照组的2.33倍。35 ℃高温处理对叶用莴苣抽薹影响显著，能够促进叶用莴苣提早抽薹。

图2 不同温度处理下叶用莴苣茎长变化(P<0.05)

2.3 不同温度处理下叶用莴苣茎尖生长点变化

为进一步探究高温对叶用莴苣抽薹的影响，运用石蜡切片技术观察植株茎尖生长点在不同温度处理下抽薹前后的变化。25 ℃处理下3、5、7、9 d茎尖生长点均呈现扁平状态，未出现生长锥凸起现象，说明植株一直处于营养生长状态，未发生抽薹现象。35 ℃处理下，第3天呈现扁平状，无顶端生长点凸起现象；第5天生长点开始略有凸起，微微呈拱形，植株开始进行发芽分化；第7天抽薹时，出现圆锥形生长点，顶端分生组织凸起明显。第9天时生长点继续生长，表明植株茎进一步伸长，见图3。

注：A-D分别为25 ℃处理3、5、7、9 d植株，E-H分别为35 ℃处理3、5、7、9 d植株

3 讨 论

抽薹对植物产量和品质影响巨大，尤其对于以叶为食用部位的植物，抽薹开花使其营养价值降低，口感苦涩，因此抑制抽薹开花是保障高产和品质的关键[17]，叶用莴苣是温敏型蔬菜，高温引起抽薹造成食用经济价值丧失的现象屡见不鲜。‘s39’是叶用莴苣热敏易抽薹品种，常温下生长45 d抽薹[18]，明确叶用莴苣‘s39’在高温胁迫下抽薹时间以及抽薹前后形态变化，对研究叶用莴苣抽薹的生理和分子机制具有关键意义。本研究选取中国夏季普遍可达到的温度35 ℃作为高温组，以叶用莴苣正常生长温度25 ℃为对照组，35 ℃高温组，第7天发生明显抽薹现象，对照组生长状况良好，未发生抽薹现象。同时，取叶用莴苣茎尖运用石蜡切片技术观察茎尖生长点抽薹前后变化，第7天抽薹时，茎尖生长点出现圆锥形凸起，并且逐渐变大。张利利等[6]在叶用莴苣‘GB-30’和‘GB-31’抽薹特性研究中发现42 ℃高温处理下第8天发生抽薹，与本研究结果相似。高温处理7 d为叶用莴苣‘s39’抽薹时间，可为叶用莴苣高温抽薹研究提供依据。

采用石蜡切片技术操作简单，可以清晰观测到高温胁迫下叶用莴苣茎尖生长点的变化状况，试验过程中主要改良石蜡切片技术中的脱水和染色步骤，常规脱水从70%乙醇开始，每次间隔1～2 h，针对叶用莴苣茎尖细嫩、含水量大等特点，脱水时间不宜过长，因此本试验脱水选择从50%乙醇开始，每次间隔0.5 h，增加梯度，缩减间隔时间，保证茎尖组织结构的完整性。本试验摒弃传统的番红固绿染色方法，采用甲苯胺蓝染色石蜡切片技术观察茎尖生长点，能更有效使染色液和茎尖组织结合，但在试验中出现染色不均匀现象，推测是由于试验过程中换新染料溶液或是溶液比例不当的原因。采用传统切片方式进行切片，出现样品切碎或变形等问题，对叶用莴苣茎尖伤害较大。后续应该进一步探究适合叶用莴苣茎尖生长点的石蜡切片方法，使之更加简便易操作。