肝细胞生长因子及RECK在胃癌组织中的表达及临床意义

孟宁，周谦，赵静，刘晟楠，曹云丽

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤死亡的第二位[1]。由于胃癌发病具有隐匿性，早期症状不典型，一经发现多处于中晚期，治疗手段有限，远期预后较差。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种重要的抗纤维化因子，通过自主分泌和旁分泌作用于血管内皮细胞，从而发挥促分裂、趋化及血管构造的作用，广泛参与肿瘤的发展和转移[2]。Kazal基序富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs, RECK)是近年来新发现基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)的抑制剂，可在转录后水平抑制多种MMPs的活性，并进而抑制肿瘤血管生成，从而阻断肿瘤细胞的侵袭和转移[3]。本试验采用免疫组化方法检测胃癌组织及相应癌旁正常组织中HGF及RECK的表达，分析其与胃癌临床病理参数之间的关系，并分析两者在胃癌组织中表达的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年5月—2016年11月石家庄市人民医院普外科确诊胃癌患者60例手术标本，分别取其胃癌组织及相应的癌旁正常组织。纳入标准：手术病理诊断明确，临床病理资料完整，术前未行放化疗及其他抗肿瘤治疗，未合并其他恶性肿瘤或胃癌复发后再次手术者。其中男50 例，女10 例。年龄47～80岁，中位年龄65.5岁。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 观察指标与方法 (1)胃癌组织及癌旁正常组织HGF及RECK的表达检测： HGF及RECK兔抗人单克隆抗体均购自美国Abcam公司，兔SP免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组化采用S-P三步法检测胃癌组织及相应的癌旁正常组织HGF及RECK。免疫组化分析结果采用半定量评分系统，由2位病理医师分别双盲阅片：HGF及RECK阳性均定位于细胞质。在切片及染色均匀的区域，选取5个高倍镜视野 (×100)，按染色细胞数的百分率及细胞着色强度作为判断标准。①细胞着色程度判定(染色深浅需与背景着色相对比) ：0分(不着色)，1分(淡黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色)；②阳性细胞所占的百分比判定：0分(无阳性细胞表达)，1分(阳性细胞≤10%)，2分(阳性细胞11%～50%)，3分(阳性细胞51%～75%)，4分(阳性细胞>75%)。根据2项评分之积，≤3分为阴性表达，>3分为阳性表达。(2)收集胃癌患者临床病理资料。

1.3 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计数资料用频数或率(%)表示，采用χ2检验；胃癌HGF和RECK表达之间的相关性采用Spearman相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌组织及癌旁正常组织中HGF及RECK的表达比较 胃癌组织及癌旁正常组织中HGF阳性表达率分别为80.0% (48/60) 和56.7% (34/60)，差异有统计学意义(P<0.01)。胃癌组织及癌旁正常组织中RECK阳性表达率分别为 58.3% (35/60)和91.7%(55/60) ，差异有统计学意义(P<0.01),见表1。HGF和RECK在胃癌及癌旁正常组织中的表达见图1。

表1 胃癌及癌旁正常组织中HGF和RECK的表达比较 [例(%)]

注：A.胃癌组织HGF表达；B. 癌旁正常组织HGF表达；C.胃癌组织RECK表达；D. 癌旁正常组织RECK表达

2.2 HGF、RECK阳性表达与胃癌患者临床病理参数之间的关系 60例胃癌组织中，HGF和RECK均主要定位于肿瘤细胞的细胞质。HGF阳性表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤直径、T分期无关(P>0.05)。RECK阳性表达与T分期、TNM分期、淋巴结转移相关(P<0.05)。而与患者性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度无关(P>0.05)，见表2。

2.3 胃癌组织中HGF及RECK表达之间的相关性 采用Spearman相关性分析得出，胃癌组织中HGF与RECK阳性表达呈负相关(r=-0.423，P<0.05)。

2.4 胃癌组织中HGF及RECK阳性表达与预后的关系 根据术后病理HGF及RECK的表达情况，将患者分为HGF阳性亚组(n=48)和HGF阴性亚组(n=12)，RECK阳性亚组(n=35)和RECK阴性亚组(n=25)。HGF阳性亚组术后1年无瘤生存率与HGF阴性亚组比较差异无统计学意义(P>0.05)，术后3年无瘤生存率低于HGF阴性亚组(P<0.05)。RECK阳性亚组术后1年无瘤生存率与RECK阴性亚组比较差异无统计学意义(P>0.05)，术后3年无瘤生存率与RECK阴性亚组比较虽有一定的生存优势，但差异亦无统计学意义(P>0.05)，见表3。

3 讨 论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，因早期无典型临床症状，发现时大多已发生局部浸润甚至远处转移，从而失去了最佳的手术机会，远期预后较差。HGF最初仅被认为是肝细胞增殖的丝裂原之一，后来发现其在肿瘤发生发展中发挥着重要作用[4]。HGF主要由间质细胞产生，通过自主分泌和旁分泌作用于血管内皮细胞，从而发挥促分裂、趋化及血管构造的作用。HGF与其受体c-Met结合后，可以激活血管内皮细胞的增殖，减弱细胞之间的黏附作用，增强细胞运动和迁移，参与肿瘤新生血管的生成，并促进肿瘤的远处转移[5]。近年来研究表明，HGF、c-Met的过度表达，HGF/c-Met信号通路的激活可能在胃炎到胃癌的发生发展过程中起重要作用，可能成为胃癌的潜在治疗靶点[6-8]。本研究发现，HGF在胃癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织，提示HGF可能参与了胃癌的发生及演变过程。在胃癌组织中HGF在低分化组的表达明显高于高—中分化组，在TNM Ⅲ+Ⅳ期组中明显高于TNMⅠ+Ⅱ期组，且在有淋巴结转移组中明显高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。提示HGF与其受体结合后启动了HGF/c-Met信号通路，破坏细胞之间的连接，影响肿瘤细胞间的黏附作用，诱导细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解，通过破坏基底膜和增加蛋白水解来促进肿瘤的侵袭转移。Li等[9]的研究表明，HGF/c-Met可以活化β黏连蛋白，在减少细胞间黏附而促进细胞移位过程中发挥一定作用。Han等[10]的研究发现，在培养基中加入HGF处理后的胃癌SUN-16细胞形态发生了明显的改变，同时伴有细胞膜E-cadherin的下调，表现出了较强的侵袭作用。Sawada等[11]在对卵巢癌细胞的研究中通过RNA干扰技术成功抑制了c-Met的活性，减少了肿瘤细胞对细胞外基质的破坏，从而降低了肿瘤细胞的侵袭能力。在对肝癌的研究中，Goyal等[12]提出HGF/c-Met信号通路促进了肿瘤新生淋巴管及新生血管的生成，进而在肿瘤转移方面起到一定作用。此外，还有学者提出HGF/c-Met通过上调环氧合酶的基因表达和增加前列腺素的合成，从而影响胃癌的生长和转移[13]。 然而，鉴于肿瘤发生发展的复杂性，其具体机制还需进一步研究。

表3 不同HGF及RECK表达情况患者术后1年、3年无瘤生存率比较 [例(%)]

表2 60例胃癌组织中HGF和RECK阳性表达与临床病理参数的关系 [例(%)]

RECK基因是1998年Takahashi等在v-Ki-ras转染的细胞株NIH3T3中通过表达克隆的方法分离出来的。RECK可以通过直接抑制酶的活性，调节酶从细胞的释放及对细胞表面的酶阻断等多种机制，抑制包括MMP-2、MMP-9在内的多种MMPs活性[14]。RECK高表达时，MMPs的活性降低到不能使ECM重塑，已有血管发出的新生毛细血管及产生的新管腔亦被抑制[15]，从而发挥其抑制新生血管生成的作用。本研究结果提示，RECK在胃癌组织中的阳性表达率为58.3%，明显低于癌旁正常组织。RECK的阳性表达与肿瘤T分期、TNM分期、有无淋巴结转移显著相关(P<0.05)，且随T分期、TNM分期的提高及淋巴结转移的出现而降低。RECK与患者的性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤分化程度无关(P>0.05)。Song等[16]在对胃癌组织研究中发现，RECK的表达与淋巴结转移及患者的临床分期呈明显负相关，这与本研究结论相似。在三阴乳腺癌组织中，RECK蛋白表达下调，可减弱对MMP9的抑制作用，从而促进肿瘤细胞的浸润和转移，并对患者的预后有一定的预测作用，为临床治疗提供参考[17]。对HGF在胃癌T分期的分析中，发现其在T1+T2组中的阳性率为66.7%，在T3+T4组中的阳性率为81.5%，差异无明显统计学意义(P>0.05)，这与谷光福等[18]的研究存在差异，可能因为本研究收治的患者大多为中晚期，早期病例较少，存在样本选择性偏移，有待于今后扩大样本量再做进一步的研究。

根据术后病理HGF及RECK的表达情况，对患者进行了不同的分组，发现不同HGF及RECK表达亚组间术后1年无瘤生存率差异不显著。HGF阳性亚组术后3年无瘤生存率低于HGF阴性亚组，提示术后病理HGF阳性表达的患者，预后多不佳。RECK阳性亚组术后3年无瘤生存率与RECK阴性亚组比较虽有一定的生存优势，但差异无统计学意义，需要扩大样本量进行进一步的统计研究。相关性分析表明，胃癌组织中HGF与RECK的表达呈明显的负相关，随着RECK表达阳性率降低，HGF阳性率显著升高，从而激活相应的信号通路促进胃癌的侵袭和转移。

综上所述，HGF过表达和RECK低表达可能参与了胃癌的发生、发展。HGF通过激活HGF/c-Met信号通路加速了细胞外基质的降解，从而促进了肿瘤的侵袭和转移；RECK通过抑制某些MMPs的活性和新生血管的形成，发挥其肿瘤抑制基因的作用。术后病理HGF阳性表达的患者，预后多不佳，而术后病理RECK阳性表达的患者，具有一定的生存优势，但无统计学意义。联合检测HGF和RECK为临床上预测胃癌侵袭转移、预后评估及指导合理的综合治疗等提供了重要的理论依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

孟宁、周谦：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；赵静：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；刘晟楠：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；曹云丽：进行统计学分析