皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)不同部位肌肉的蛋白分布特性

尹蕾丽,周 纷,姚林燕,王锡昌,*

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306; 2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306; 3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海 201306)

鲍鱼又称鳆鱼、海耳等,属软体动物门(Mollusca),腹足纲(Gastropoda)、鲍科(Haliotidae),是我国名贵的海产品,由于其营养含量丰富、味道鲜美及口感独特,深受全世界人们的喜爱[1-3]。我国是世界第一养鲍大国,随着经济的发展及市场需求的提高,鲍鱼的养殖产量呈逐年上升趋势,据2018中国渔业年鉴统计,总产量约为16.3万吨,相比2017年增长了9.85%[4],鲍鱼现已成为家庭餐桌上的常见食材。我国现共有七大经济鲍类,其中皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)是个头最大、品质最好、销量最高的。

目前国内外对鲍鱼的研究主要集中在养殖[5-6]、生长特性[7]、副产物开发[8-10]及加工特性[11-12]等方面,而对鲍鱼原料学属性的关注较少。除活品外,鲍鱼常见的销售形式还有冷冻、干制及罐装等,在日本,鲍鱼也常常被制作成刺身后进行销售和食用[2-3]。不同的加工方式,对肌肉的滋味、口感及营养等方面均会带来不同的程度影响,而这与肌肉本身特性息息相关。虽然已有学者[13-15]对鲍鱼肌肉质地方面进行过相关性研究,但我国对鲍鱼肌肉性质的基础性研究依然薄弱。

肌原纤维蛋白与胶原蛋白是构成鲍鱼肌肉的主要蛋白,其相对含量、相互作用等对于肌肉质地的影响较大[16]。肌原纤维蛋白可以维持肌肉细胞骨架的完整性,而胶原蛋白的含量与肌肉的嫩度显著相关[17]。另外,值得注意的是鲍鱼肌原纤维蛋白中副肌球蛋白含量较高,这对鲍鱼在加工过程中肌肉质地的变化有着重要影响[16]。因此,本研究从食品原料学角度出发,对皱纹盘鲍不同部位肌肉的营养、蛋白组成、分布及微观组织展开初步研究,为后续加工方式对肌肉特性影响的研究提供理论依据,完善我国鲍类肌肉特性的基础性研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai) 上海芦潮港海鲜市场;CuSO4、K2SO4优级纯,上海麦克林生化科技有限公司;二甲苯 分析纯,上海生工生物有限公司;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂 美国Sigma公司;Van Gieson试剂盒 上海源叶生物科技有限公司。

H2050R高速冷冻离心机 长沙湘仪有限公司;FOSS8400凯氏定氮仪 福斯分析仪器公司;RM2245石蜡切片机 德国莱卡公司;ECLIPSE 80i高级研究级显微镜 上海尼康仪器有限公司;MesoMR23-060H.I低场核磁共振成像分析仪 上海纽迈科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 2019年11月上旬,从上海市芦潮港海鲜市场某海鲜批发店购入同一捕捞地点、时间及批次的皱纹盘鲍,活体运输至上海海洋大学研究室,个体平均质量为(34.96±2.78) g。将活品鲍鱼清洗后去壳、去内脏等,后进行分离。

1.2.2 腹足肌肉组成 按照图1所示,将腹足肌肉分成闭壳肌(A)、过渡区(B)及裙边(C)三部分进行后续测定。

图1 皱纹盘鲍腹足肌肉的划分Fig.1 Division of H. discus hannai muscle

1.2.3 基本营养成分测定

1.2.3.1 水分的测定 参照GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》。

1.2.3.2 粗蛋白的测定 参照GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法。

1.2.3.3 粗脂肪的测定 参照GB 5009.6-2016索氏抽提法。

1.2.3.4 灰分的测定 参照GB/T 5009.4-2016高温灼烧法。

1.2.3.5 总糖的测定 参照GB 9695.31-2008分光光度法。

1.2.4 蛋白的分离 含氮物的分离参照张龙[18]的方法,并略有修改。具体操作:取2.5 g样品于离心管中,加入6倍体积0.1 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液,均质90 s后,以300 r/min的转速搅拌30 min,然后在12000×g的转速下离心10 min,保留上清液,在沉淀中继续加入6倍体积0.1 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液搅拌、离心(同上),此过程重复2遍,合并上清液即为水溶性蛋白。随后在沉淀中加入6倍体积0.6 mol/L的NaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)缓冲液搅拌、离心(同上),重复4次,合并上清液即为盐溶性蛋白。在沉淀中加入6倍体积0.1 mol/L的NaOH溶液搅拌,过夜搅拌,离心(同上)取得的上清液即为碱溶性蛋白,沉淀为基质蛋白,所有操作均在4 ℃下进行。

1.2.5 蛋白分布测定 将蛋白溶液与电泳上样液以4∶1的比例混合,于100 ℃煮沸5 min制得电泳样品。采用SDS-PAGE法进行蛋白组分分析,参照张龙[18]的方法,其中浓缩胶质量分数为5%,分离胶质量分数为7.5%。

1.2.6 显微结构观察 将鲍鱼切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方体浸入10%福尔马林中固定24 h,接着用70%、85%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ逐级脱水4 h、2 h、2 h、1 h、30 min及30 min,后将样品置于乙醇与二甲苯混合液(1∶1)中浸泡5 min,取出置于二甲苯I溶液(100%)中浸泡10 min,取出后立即放入二甲苯II溶液(100%)中浸泡10 min左右,待样品呈现透明状态时结束浸泡,然后将样品浸入65 ℃石蜡中包埋3 h后,切片、烤片、采用Van Gieson染色后在光学显微镜下观察。

1.3 数据分析

所有实验组测定3平行,数据用平均值±标准差表示,使用SPSS 17.0软件和Microsoft Excel 2019进行数据处理,采用Duncan法进行显著性差异分析处理,显著水平P<0.05。

表2 皱纹盘鲍腹足不同部位肌肉的基本营养成分分析Table 2 Analysis of the basic nutrient composition of muscles in different parts of H. discus

2 结果与分析

2.1 腹足肌肉组成

表1为鲍鱼腹足不同部位肌肉的一般质量组成。鲍鱼属于单壳贝类,与以贝柱为主的扇贝不同的是,鲍鱼的整个腹足肌肉部分是其可食部位,主要由肌原纤维蛋白和胶原蛋白所构成。研究表明,鲍鱼的闭壳肌主要由肌原纤维蛋白构成,而裙边部分主要是胶原蛋白,从中心到边缘部分,肌原纤维蛋白的含量逐渐减少,胶原蛋白的含量逐渐增多[15,17]。另外,胶原蛋白的含量与肌肉的韧性存在相关性,含量越高,肌肉质地越紧实[17],因此对腹足肌肉部分进行细分和研究是有必要的。从表1中可以看出,鲍鱼肌肉中闭壳肌部位质量占比最多,高达38.99%,其次为过渡区及裙边部分,整个腹足肌肉占总重量约35%左右。与菲律宾蛤仔(3.00%)、虾夷扇贝(12.41%)、海湾扇贝(11.24%)、栉孔扇贝(14.08%)等[18-19]相比,其可食部分所占比例较大。

表1 鲍鱼不同部位肌肉占腹足及整贝的质量比(%)Table 1 The general weight compositionsof H. discus hannai(%)

2.2 基本营养成分分析

皱纹盘鲍不同部位肌肉的基本营养成分分析结果如表2所示。从肌肉的中心到边缘部位,水分含量呈显著递增趋势(P<0.05),而粗脂肪含量呈显著递减趋势(P<0.05),这与郝林娟等[13]对鲍鱼不同部位肌肉研究的结果相似。与其他贝类相比,皱纹盘鲍的蛋白含量较高,其含量高于菲律宾蛤仔(6.91%～10.39%)[18]、华贵栉孔扇贝(14.30%)[20]、长江口河蚬(9.29%)[21]及翡翠贻贝(10.60%)[22]等,而脂肪含量又远低于丽文蛤(3.52%)、海湾扇贝(2.21%)[23]及虾夷扇贝(1.24%)[24]等,是一种高蛋白低脂肪的贝类。三个部位的肌肉在灰分含量方面不存在显著性差异(P>0.05),裙边部分的总糖含量显著低于闭壳肌及过渡区部分(P<0.05),这与肖桂华等[14]的研究结果相似。一般来说,贝类中作为主要能量贮藏形式的糖原含量较为丰富,其含量会随季节、产地的不同而有所不同[25]。另外,糖原的浓度与水分呈负相关,当糖原浓度最高时,鲍鱼的滋味最鲜美[26]。

2.3 蛋白组成分析

鲍鱼肌肉中蛋白组成如表3所示。口感、滋味、营养等特性是鲍鱼作为名贵水产品深受人们的喜爱原因。从部位来看,闭壳肌、过渡区及裙边中非蛋白氮含量不存在显著性差异(P>0.05)。非蛋白氮中包含了一些小分子多肽、游离氨基酸、核苷酸等物质,它们对呈味起重要作用[25]。在盐溶性蛋白、碱溶性蛋白和基质蛋白含量上三个部位存在显著性差异(P<0.05),表现为从边缘到中间盐溶性蛋白与碱溶性蛋白含量依次增加,而肌基质蛋白含量逐渐减少。碱溶性蛋白主要是一些变性蛋白,如交联的肌原纤维蛋白,其含量的变化与蛋白质中氢键、离子键、二硫键等的形成相关[27-28]。盐溶性蛋白和胶原蛋白是维持肉细胞结构完整的两种主要的蛋白[16],含量的变化在一定程度上可以反映蛋白质变性情况。另外,可以发现裙边部分基质蛋白含量约为过渡区的两倍,闭壳肌部分的三倍。基质蛋白中主要成分为胶原蛋白,含量随部位的变化与Olaechea[17]、郝林娟[13]、肖桂华[14]等的研究一致。胶原蛋白是结缔组织的主要成分,也是肌肉中另一种重要作用的蛋白质。胶原蛋白不仅可以作为蛋白质与多糖相互作用网络的重要组成部分,还可以影响细胞骨架的网络结构,介导细胞粘附及细胞迁移[29]。研究表明鲍鱼腹足肌肉中肌原纤维蛋白含量约占总蛋白的40%～50%,胶原蛋白约占20%～35%[30],与本实验研究结果相似,但样品及蛋白分离方法的不同也会产生不一样的结果[31]。

从蛋白含量来看,各组织中盐溶性蛋白(30.59%～42.22%)与非蛋白氮(33.68%～35.16%)含量相对较高,水溶性蛋白(2.39%～2.85%)含量相对较低。水溶性蛋白的存在对肌原纤维蛋白凝胶性有一定影响,据报道,将肌浆蛋白加入富含肌原纤维蛋白的鱼糜中可增强鱼糜的强度、弹性、硬度等,改善其质地特性[32-33]。另外,肌浆蛋白对肌肉的色泽、保水性也有影响。Mcloughlin等[34]发现肌浆蛋白沉淀会掩盖肌浆的红色,导致猪肉色泽发白。闭壳肌与过渡区的蛋白组成相似,含量依次为盐溶性蛋白>非蛋白氮>碱溶性蛋白>基质蛋白>水溶性蛋白。裙边略有不同,含量最高的为非蛋白氮,达34.19%,剩下的依次为盐溶性蛋白、基质蛋白、碱溶性蛋白和水溶性蛋白。一般来说,非蛋白氮的含量越高,肌肉的风味越好[35-37]。

表3 皱纹盘鲍腹足不同部位肌肉蛋白组成分析Table 3 Analysis of muscle protein composition in different parts of H. discus hannai

图2 皱纹盘鲍腹足不同部位肌肉的SDS-PAGE图Fig.2 SDS-PAGE patterns of proteins in different parts of H. discus hannai注:M. 标准蛋白;1. 闭壳肌;2. 过渡区;3. 裙边。

2.4 蛋白分布分析

图2显示了鲍鱼不同部位肌肉的蛋白的SDS-PAGE图。从图2中可以看出,鲍鱼的全蛋白分子量分布在25～245 kDa范围内,蛋白分布模式相似,种类丰富,主要以肌球蛋白重链(220 kDa)、副肌球蛋白(100 kDa)和肌动蛋白(48 kDa)为主。由中心到边缘部位,在135～245 kDa和25～35 kDa之间的蛋白条带变浅或消失,这可能与上面所测的蛋白含量相符合。另外,可以发现在245 kDa附近有明显条带,推测可能为肌球蛋白重链多聚体、胶原蛋白等[18]。

水溶性蛋白中主要含有一些与糖酵解有关的酶类,AMP-脱氨酶、小清蛋白和细胞色素C等水溶性物质[38]。由水溶性蛋白的SDS-PAGE图中可以看出,三个部位的蛋白条带较多,分布相似,无明显新的条带产生。但裙边在135～180及<48 kDa 范围内的蛋白条带少于其他两部位。

肌原纤维蛋白由粗丝和细丝构成,粗丝主要包括肌球蛋白与副肌球蛋白,细丝主要包括肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白。由盐溶性蛋白的SDS-PAGE图可以看出,肌原纤维蛋白也是主要以肌球蛋白重链、副肌球蛋白、肌动蛋白为主,这与郝林娟等[13]报道的南日鲍蛋白组成类似。软体动物与脊椎动物最大的不同点在于副肌球蛋白含量特别高,在鲍鱼肌原纤维蛋白中的含量可达35.8%[16]。少量的副肌球蛋白有助于肌肉凝胶的形成,赋予凝胶制品更好的弹性,但过量则会使凝胶制品变得坚硬[39-40]。裙边在<35 kDa部分条带基本不可见,且主要的蛋白条带较细,说明其所含的蛋白含量较低,这与上述所测的蛋白分布结果一致。

碱溶性蛋白中所含条带较少,蛋白组成较简单。可以发现,裙边部分只在100及42 kDa附近看到明显条带,可能是因为这部分所含的变性蛋白较少。胶原蛋白是基质蛋白的主要组成成分,其含量与肌肉的韧性紧密相关[16-17]。无脊椎动物中胶原蛋白主要为I型和V型,其中I型广泛存在于间质结缔组织中,V型广泛存在于细胞周围结缔组织中[29,41]，图中在>245 kDa以上有蛋白条带存在,推测为交联结缔组织。三部分肌肉在100～135 kDa存在条带,推测为胶原蛋白的α链。胶原蛋白有α、β、γ三种构象,两条α链可组成一条β链,三条α链可组成一条γ链[42]。袁起新[42]对鲍鱼胶原蛋白性质的研究中发现,鲍鱼可能存在两种或多种类型的胶原,其中主要的结构类型为(α1)3,另外的结构需要通过免疫印迹鉴定。

2.5 显微结构观察

图3 皱纹盘鲍不同部位肌肉的光学显微结构图Fig.3 Light microscopical feature of muscles in different parts of H. discus hannai注:A、B、C分别表示闭壳肌、过渡区及裙边三部分;1、2分别表示肌肉的横切面与纵切面。

图3所示为皱纹盘鲍不同部位肌肉在光学显微镜(200倍)下的横切与纵切图片。根据Van Gieson染色原理,肌纤维呈现黄色,而胶原纤维呈现红色。从图中可以看到从闭壳肌到裙边部分,黄色逐渐减少,而红色逐渐增多,表明肌原纤维呈递减趋势而胶原纤维呈递增趋势,这与图2的测定结果相一致,且与肖桂华等[14]、Øiseth等[43]的研究结果相同。另外,可以发现相同部位肌肉的横切面与纵切面存在差异性。在横切面中纤维主要呈点状,少量条状存在,而纵切面中纤维主要呈条状,胶原随机分布在肌纤维中间。闭壳肌部分的纤维粗短,分布存在一定的方向性,纤维间间隙较小,而裙边部分纤维细长排列呈杂乱无序,纤维间间隙较大。对于海洋软体动物来说,纤维束的直径、粗细及纤维与纤维间的距离等都会影响鲍鱼肌肉的质地,纤维束越小,肌肉越紧实[43]。这些形态上的差异与后续加工中肌肉的品质同样密切相关。

3 结论

皱纹盘鲍不同部位肌肉在营养成分、蛋白含量及分布、组织结构都存在一定的差异,这将会对肌肉质地产生不同程度的影响。研究结果表明三个部位中闭壳肌部分在营养含量方面优于其他两部分。此部分肌肉中肌原纤维蛋白含量较高且肌肉组织紧密、纤维间隙较小,而裙边部分胶原蛋白含量较高且肌纤维间间隙较大。本实验通过对肌肉中几种不同蛋白特性的研究以探索蛋白特性与其食用品质之间的关联性,丰富我国水产品基础性研究数据,为今后鲍鱼的深加工提供相关的理论支撑和实践依据。由于不同部位肌肉的差异性,今后工业上可以针对其不同位置肌肉硬度、韧性的不同,针对不同人群(老人、儿童、年轻人)的食用习惯开发出新的产品。此外,针对不同位置的蛋白差异性,本研究还可为今后冻品加工中保鲜剂的使用(位置、方式)提供新的思路。