基于网络药理学的桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病机制研究

辛高杰，付建华，韩笑，李磊，郭浩，孟红旭，赵雨薇，贾飞凡，刘建勋

基于网络药理学的桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病机制研究

辛高杰1，付建华1，韩笑1，李磊1，郭浩1，孟红旭1，赵雨薇1，2，贾飞凡1，刘建勋1

1.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，北京 100091；2.滨州医学院中西医结合学院，山东 烟台 264003

采用网络药理学方法研究活血化瘀药桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的作用机制。采用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选药物成分及成分靶点，通过Genecards数据库进行疾病靶点预测，利用String平台进行蛋白相互作用（PPI）分析并构建PPI网络，应用Cytoscape3.6.1软件构建桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的成分-靶点-疾病网络，利用Bioconductor中R包clusterprofile version3.14.2进行GO功能注释和KEGG通路分析。筛选出桃仁-红花药对化学成分45个，作用靶点105个；PPI网络共有节点78个，边796条，平均度值20.41；GO分析条目共92个，包括血红素结合、细胞因子受体结合、过氧化酶活性、生长因子受体结合等；KEGG信号通路121条，包括白细胞介素-17信号通路、T细胞受体信号通路、血管内皮生长因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路、核因子-κB信号通路、HIF-1信号通路等。桃仁-红花药对通过多靶点、多通路治疗缺血性心脏病，涉及的生物学途径可能包括炎症、血流动力学、氧化应激、细胞凋亡、信号传导等。

网络药理学；桃仁-红花药对；缺血性心脏病；作用机制

缺血性心脏病在心血管疾病中较为常见且危害严重，近年来发病率逐年升高[1]，预防和治疗缺血性心脏病的手段和药物亟待被挖掘。桃仁质重，善入里祛病位在下的瘀血，红花质轻，可祛病位在上的瘀血，桃仁、红花配伍通达一身上下之瘀血，治疗缺血性心脏病血瘀证效果显著，是治疗本病代表方剂（桃红四物汤、桃仁红花煎、血府逐瘀汤、补阳还五汤等）中起活血化瘀作用的经典药对[2-5]。但桃仁-红花药对成分复杂，作用机制尚未完全阐明，目前基础研究多基于动物或离体细胞，其对人体缺血性心肌的作用机制尚不清楚，探讨桃仁-红花药对保护人缺血心肌的具体机制有重要意义。

网络药理学整合系统生物学、高通量组学、网络数据库检索等多学科知识和方法，具有整体性和系统性的特色，与中医学整体观和辨证论治特点相契合，从整体观角度分析中药作用的复杂网络，为中医药研究提供新思路[6]。本研究利用网络药理学方法对桃仁-红花药对成分和作用靶点及缺血性心脏病蛋白靶点进行数据挖掘，将成分-靶点-疾病网络进行可视化，构建桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病靶点的蛋白相互作用（PPI）网络，并进一步对靶点蛋白基因和通路进行富集分析，从整体观角度和分子层面对桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的具体机制进行研究，与已有实验研究结果相互补充，以期探索新的作用机制，丰富活血化瘀药对桃仁-红花治疗缺血性心脏病的科学内涵。

1 资料与方法

1.1 药物和疾病靶点收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[17]收集桃仁和红花的所有化学成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件筛选活性成分，并收集活性成分的作用靶点，获得药物靶点，构建药物活性成分、蛋白靶点数据集。通过Genecards数据库（https://www.genecards.org/），以“Ischemia Heart Disease”为检索词，检索缺血性心脏病相关靶点，建立疾病靶点数据集。应用Uniprot数据库对得到的药物活性成分蛋白靶点、疾病蛋白靶点名称进行规范化。

1.2 活性成分-靶点-疾病网络构建

将桃仁-红花药对的化学成分、成分作用靶点、缺血性心脏病治疗靶点进行整合，利用Cytoscape3.6.1软件将桃仁-红花药对的成分靶点蛋白与缺血性心脏病靶点蛋白进行合并，用“节点”表示活性成分与作用靶点，“边”表示活性成分与作用靶点之间的关系，得到桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的“成分-靶点-疾病”网络图，阐释桃仁-红花药对的活性成分与缺血性心脏病相关靶点之间的关系。

1.3 蛋白相互作用网络构建

利用String平台（https://string-db.org/），设置物种为人类（Homo sapiens）、最低相互作用阈值为0.4，构建PPI网络图，展示桃仁-红花药对作用靶点蛋白与缺血性心脏病疾病靶点蛋白之间的相互作用关系。

1.4 GO和KEGG通路富集分析

利用Bioconductor（http://www.bioconductor.org/ about/）中R包clusterprofile version3.14.2对蛋白靶点进行GO功能富集分析，绘制GO分析条目图，研究桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的潜在靶点。对药物化学成分作用蛋白靶点进行KEGG通路富集分析，得出PPI网络中直接作用靶点分布的相关通路，进一步说明化学成分的靶点蛋白在信号通路中的作用。

2 结果

2.1 桃仁-红花活性成分及缺血性心脏病靶点

通过TCMSP筛选得到与桃仁相关的化学成分23个、作用靶点20个，与红花相关化学成分22个、作用靶点103个，将桃仁和红花中存在靶点对应的化合物合并，即为两药的共有化合物。合并两药的相同作用靶点18个，得到作用靶点105个。通过Genecards数据库筛选出缺血性心脏病相关靶蛋白3196个，应用Uniprot数据库将得到的药物活性成分蛋白靶点、疾病蛋白靶点名称规范化后取交集，得到桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病靶点79个。

2.2 成分-靶点-疾病网络

桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的成分-靶点-疾病网络见图1，包括桃仁-红花药对活性成分共45个，药物与疾病交互作用靶点79个，可直观看出药物化学成分与疾病靶点之间的网络关系。quercetin（槲皮素）的作用靶点最多，度值为59，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-麦胚固醇）、luteolin（木犀草素）、baicalein（黄芩苷元）靶点度值分别为25、25、24、17，这些连接靶点较多的活性成分可能在桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病中发挥重要作用。蛋白靶点中，PTGS1（前列腺素内过氧化物合酶1）、PGR（黄体酮）、CHRM1（毒蕈碱受体）分别与15、14、9个活性成分相连。此外，该网络中每个蛋白靶点至少有2个活性成分与之相连，每个活性成分也至少有2个作用靶点，表明桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病是多成分、多靶点的复杂网络，与中药作用的复杂性一致。

注：紫色三角代表活性成分，红色圆形代表作用靶点

2.3 桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病蛋白相互作用网络

通过String平台得到桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病对应靶点的PPI网络（见图2），包括78个节点（删除1个游离靶点）、796条边，平均度值为20.41。一般认为，节点连接的边数越多，其度值越高，该相互作用蛋白在网络中的作用就越重要。该网络中度值较高的蛋白靶点有IL6（白细胞介素-6）、ALB（血清白蛋白）、MAPK8（丝裂原活化蛋白激酶8）、EGFR（表皮生长因子受体）、VEGFA（血管内皮生长因子A），度值分别为55、52、50、49、47。

缺血性心脏病病理机制复杂，IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、EGFR等蛋白靶点是缺血性心脏病病理过程中的关键靶点。IL6是一种炎症因子，与缺血性疾病发生时白细胞的浸润等炎性病理变化密切相关[7]。VEGFA是血管内皮生长因子的一种亚型，缺血缺氧时VEGFA表达升高，诱导新生血管的形成[8]。EGFR与VEGFA作用类似，在促进血管生成、调节血流动力学等方面发挥重要作用，与血液动力学改变有关[9]。活血化瘀药对桃仁-红花可能通过作用于这些蛋白靶点，干预缺血性心脏病发生时炎症反应、血管新生、细胞凋亡等过程。

2.4 GO富集分析结果

对桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病涉及的79个靶点蛋白进行GO分析，得到分析条目92个，按值排序的前20位结果见图3。可以看出，靶点蛋白涉及的基因功能包括heme binding（血红素结合）、cytokine receptor binding（细胞因子受体结合）、antioxidant activity（抗氧化）、peroxidase activity（过氧化酶活性）、growth factor receptor binding（生长因子受体结合）等方面。

2.5 KEGG通路富集分析结果

对桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病涉及的79个靶点蛋白进行KEGG信号通路分析，得到121条信号通路，根据值和涉及的靶点基因数进行排序，前20位的通路见图4。可以看出，桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病集中的通路主要包括以下几方面：参与缺血性心脏病发生时炎症反应的IL-17 signaling pathway（白细胞介素-17信号通路）、T cell receptor signaling pathway（T细胞受体信号通路）等；参与血流动力学调节的VEGF signaling pathway（血管内皮生长因子信号通路）；参与细胞恶性增殖的TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）等；参与内分泌调节的相关通路Fluid shear stress and atherosclerosis（流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路）、Estrogen signaling pathway（雌激素信号通路）等；参与细胞凋亡的PI3K-Akt signaling pathway（PI3K-Akt信号通路）、MAPK signaling pathway（MAPK信号通路）、p53 signaling pathway（p53信号通路）等；参与信号传导的NF-kappa B signaling pathway（核因子-κB信号通路）、HIF-1 signaling pathway（缺氧诱导因子-1信号通路）等。

图3 桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病GO富集分析

图4 桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病KEGG通路富集分析

3 讨论

本研究收集桃仁-红花药对活性成分45个，治疗缺血性心脏病蛋白靶点79个，分析结果提示桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病具有多成分、多靶点的特点，PPI网络展示了蛋白间相互作用错综复杂的关系。GO富集分析得出治疗缺血性心脏病涉及的基因包括血红素结合、细胞因子受体结合、抗氧化、过氧化酶活性、生长因子受体结合等，与缺血性心脏病发生发展过程中炎性反应、免疫反应、氧化应激损伤等病理反应有关[10-12]。KEGG通路富集发现桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病相关的通路多富集在缺血性心脏病发生时的炎症反应、血流动力学改变、细胞恶性增殖、内分泌调节、细胞凋亡调节、信号传导等方面，缺血性心脏病病理过程中炎症反应时白细胞的聚集、细胞的恶性增殖等病理变化与中医“瘀”的概念相关[13]，而与信号传导相关的通路在调节炎症、肿瘤等方面发挥重要作用，另外，血瘀证的生成又与血流动力学的改变、血液黏稠度的升高有关[14-16]，桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病作用通路的特点与其活血化瘀功效相呼应。

综上所述，本研究表明，桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的具体机制可能与调控炎症因子的表达、改善血流动力学、抑制过氧化物的产生及清除内源性氧自由基、减少心肌细胞凋亡、促进血管新生等有关。研究发现，桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的具体机制可能与抗血小板聚集、减少纤维蛋白原生成、减少炎症因子水平、减少氧自由基生成、促进血管内皮损伤修复、降糖、降血脂等有关[17-19]。本研究结果与上述实验研究成果一致。除已有研究的基因和通路外，本研究分析得到桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病还与多种基因和通路相关，如参与细胞转录过程的激活转录因子结合、与泛素化过程相关的泛素样蛋白连接酶结合等基因，参与炎症反应的NF-κB信号通路等，故桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的具体机制仍有广泛的挖掘空间[20-21]。

中药治疗缺血性心脏病具有一定优势，其具体作用机制复杂，有待进一步深入探索。桃仁和红花活性成分、药理作用均不相同，在治疗缺血性心脏病过程中既各司其职又相须为用，共同发挥活血化瘀作用。本研究可为桃仁-红花药对治疗缺血性心脏病的机制研究提供参考，但中药作用具有多成分、多靶点的复杂性，且随着剂型和配伍的改变，药理作用可能发生相应的变化，本研究所得结果存在一定的局限性，仍需不断完善。

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Study on Mechanism of Drug Pair Persicae Semen - Carthami Flos in Treatment of Ischemic Heart Disease Based on Network Pharmacology

XIN Gaojie1, FU Jianhua1, HAN Xiao1, LI Lei1, GUO Hao1, MENG Hongxu1,ZHAO Yuwei1,2, JIA Feifan1, LIU Jianxun1

To explore the mechanism of treating ischemic heart disease with the promoting blood circulation and reducing blood stasis drug pair Persicae Semen - Carthami Flos based on network pharmacology.The chemical components and targets of Persicae Semen and Carthami Flos were screened by searching the TCMSP. Genecards database was used to predict disease targets, String platform was used to analyze protein-protein interactions (PPI), and PPI network was built. The component-target-disease network of Persicae Semen - Carthami Flos drug pair for treating ischemic heart disease was constructed using Cytoscape3.6.1 software. GO function annotation and KEGG pathway analysis were performed using R package clusterprofile version 3.14.2 in Bioconductor.A total of 45 chemical components and 105 targets were identified from Persicae Semen - Carthami Flos drug pair. There were 78 nodes and 796 edges in PPI network, and the average degree value was 20.41. Totally 92 GO analysis items were obtained, including heme binding, cytokine receptor binding, peroxidase activity, growth factor receptor binding, etc.; 121 KEGG signaling pathways were obtained, including interleukin-17 signaling pathway, T cell receptor signaling pathway, VEGF signaling pathway, TNF signaling pathway, fluid shear stress and atherosclerotic signaling pathway, AGE-RAGE in diabetes complications signaling pathway, estrogen signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, MAPK signaling pathway, p53 signaling pathway, NF-κB signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, etc.Persicae Semen - Carthami Flos drug pair treats ischemic heart disease through multiple targets and multiple pathways. The biological pathways involved may include inflammation, hemodynamics, oxidative stress, apoptosis, signal transmission, etc.

network pharmacology; Persicae Semen - Carthami Flos drug pair; ischemic heart disease; action mechanism

R259.41；R285

A

1005-5304(2020)11-0106-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.201911417

国家自然科学基金（81774145）；国家重点基础研究发展计划（2015CB554406）；国家科技重大专项－重大新药创制（2018ZX09721003-009-022）

付建华，E-mail：jianhuaffcn@263.net

（2019-11-22）

（2020-01-10；编辑：陈静）