芍药苷对PINK1-Parkin介导的线粒体自噬在H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤中的影响

余婧萍，贺春香，李泽，杨苗，成绍武，宋祯彦

论著·实验研究

芍药苷对PINK1-Parkin介导的线粒体自噬在H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤中的影响

余婧萍，贺春香，李泽，杨苗，成绍武，宋祯彦

湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

观察芍药苷对过氧化氢（H2O2）诱导的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞损伤中线粒体自噬的影响，探讨其相关作用机制。采用250 μmol/L H2O2诱导SH-SY5Y细胞24 h构建细胞损伤模型。实验细胞分为空白组、模型组和芍药苷低、中、高剂量组。采用MTT法检测细胞存活率，JC-1线粒体膜电位荧光探针检测线粒体膜电位，TUNEL染色检测细胞凋亡率，Western blot检测PINK1、Parkin、LC3Ⅱ和p62蛋白的表达。与空白组比较，模型组细胞存活率下降，线粒体膜电位下降，细胞凋亡率上升，PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表达升高，Parkin蛋白表达无明显变化；与模型组比较，芍药苷低、中、高剂量组细胞线粒体膜电位上调，细胞凋亡率下降，PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表达降低，Parkin蛋白表达升高。芍药苷可显著降低H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，其机制可能与调控PINK1-Parkin介导的线粒体自噬途径相关。

芍药苷；人神经母细胞瘤细胞；过氧化氢；线粒体自噬；PINK蛋白；Parkin蛋白；信号通路

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种与年龄相关的致死性神经退行性疾病，临床以进行性的认知、学习、记忆功能障碍为主要特征。目前，全球4700万人患有AD，预计2050年AD将影响1.35亿人[1]。目前临床对AD的治疗手段十分有限，疗效欠佳。AD病理组织学特征是不溶性β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）斑块的胞外聚集和由过度磷酸化的微管相关tau蛋白组成的神经原纤维缠结（neurofbrillary tangles，NFTs）的胞内聚集。研究表明，氧化损伤是AD的主要特征，可出现在轻度认知功能障碍及Aβ沉积和NFTs形成之前[2]。氧化应激（oxidative stress，OS）是由于活性氧（ROS）及氧化与抗氧化作用失衡引起的。线粒体是细胞中ROS的主要产生部位之一，线粒体容易因基质中产生的ROS而引起氧化损伤。AD早期即存在的氧化应激状态可损伤线粒体功能[3]，线粒体选择性降解自噬（线粒体自噬）是大自噬的一种特殊形式，通过选择性清除受损和功能异常的线粒体，可保护细胞免受过度的氧化应激和细胞死亡。线粒体自噬功能障碍会导致多种神经退行性疾病，包括帕金森病和AD[4-5]。因此，探索改善神经元线粒体自噬功能障碍的有效药物，对AD的早期防治具有重要临床意义。

白芍最早记载于《神农本草经》，为毛茛科多年生草本植物芍药的干燥根。芍药苷为水溶性单萜苷，是白芍的主要有效成分之一。芍药苷具有抗炎、抗氧化、改善学习记忆能力等药理作用[6-7]。本课题组研究发现，芍药苷可通过降低过氧化氢（H2O2）诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）内的ROS水平，改善自噬-溶酶体系统功能，进而改善细胞受损状态[8]。但其对线粒体自噬调控及具体机制还不清楚。本实验通过研究芍药苷干预H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，观察其对线粒体膜电位、细胞凋亡及PINK1/Parkin信号通路的影响，探讨芍药苷对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护机制。

1 实验材料

1.1 细胞

SH-SY5Y细胞株购自中国科学院上海生命科学研究所。用含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的DMEM-F12（1∶1）培养液，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养细胞。待细胞生长至对数生长期，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化重悬细胞，显微镜下细胞计数，根据实验需求接种不同密度的细胞至各孔板中，或将细胞悬液按1∶3比例接种于新的培养瓶中传代培养。

1.2 药物和试剂

芍药苷（IP0030）、MTT（M8180）、JC-1线粒体膜电位荧光探针（J8030）、胰蛋白酶-EDTA消化液（T1320），中国索莱宝公司；二甲基亚砜（DMSO，D806645），中国麦克林公司；H2O2溶液（323381），美国Sigma公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（C1088），中国Beyotime公司；Triton X-100（9002-93-1），中国Beyotime公司；SDS-PAGE蛋白5×上样缓冲液（P0015L），中国Beyotime公司；RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer，01408/504074），康为世纪生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂混合物（CW2200），康为世纪生物科技有限公司；BCA蛋白定量分析试剂盒（NCI3227CH），美国Thermo Fisher公司；一抗Parkin（#4211），美国CST公司；一抗PINK1（sc-517353），美国SANTA CRUZ公司；一抗p62（ab56416），美国Abcam公司；一抗LC3（bs-8878R），北京博奥森生物有限公司；β-actin（bs-0061R），北京博奥森生物有限公司；山羊抗兔二抗（AP132P），美国Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠二抗（AP124），美国Sigma-Aldrich公司；10%胎牛血清，美国Gibco公司；1%青霉素-链霉素混合液，美国Hyclone公司。

1.3 仪器

ChemiDoc XRS+化学发光凝胶成像仪，美国BIO-RAD公司；Medifuge™小型台式离心机、Series 8000 WJ CO2培养箱，美国ThermoFisher公司；Axio Vert.A1倒置荧光显微镜，德国ZEISS公司；Cytation3多功能酶标仪，美国BioTek公司；A1+共聚焦激光显微镜，日本Nikon公司。

2 实验方法

2.1 过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型制作

参照本课题组前期发表文献方法制作SH-SY5Y细胞损伤模型[9]。

2.2 分组

待细胞生长至对数生长期后，将细胞接种于96孔板（约5×103个/孔）、12孔板（约1×105个/孔）和6孔板（约4×105个/孔），继续培养过夜后，给予不同处理，分别设置空白组、模型组（250 μmol/L H2O2）和芍药苷低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）剂量组。

2.3 MTT法检测细胞活率

96孔板中细胞经H2O2、芍药苷处理一定时间后，吸弃孔中培养液，每孔加入10 μL MTT和90 μL完全培养液，同时设置调零孔，继续培养4 h，吸弃培养液和MTT，每孔加入100 μL DMSO，振荡30 s，490 nm波长检测吸光度（OD值），计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（实验组OD值－调零组OD值）÷（空白组OD值－调零组OD值）×100%。

2.4 JC-1荧光探针检测线粒体膜电位

12孔板中细胞经处理后，吸弃培养基，加入工作浓度为1 µg/mL的JC-1荧光探针染液（DMSO配制），置于培养箱中继续培养20 min，PBS轻洗细胞3次，使用Axio Vert.A1倒置荧光显微镜成像观察，用Image J软件计算平均荧光强度。平均荧光强度＝光密度总和÷荧光面积。以红绿荧光平均荧光强度比值衡量线粒体去极化的比例。

2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡

12孔板中细胞经处理后，吸弃培养基，PBS洗细胞1次，4%多聚甲醛固定细胞30 min；PBS洗细胞1次，用0.3%Triton X-100（PBS配制），室温孵育5 min，PBS轻洗细胞2次；每孔加入50 μL检测液（含5 μL TdT酶和45 μL荧光标记液）；于37 ℃恒温箱中避光孵育60 min，PBS洗细胞3次；用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封片，镜下成像观察染色结果。

2.6 Western blot检测细胞相关蛋白的表达

6孔板中细胞经处理后，弃去培养基，用预冷的PBS轻洗3次，吸弃PBS；以5 μL/cm2计算，加入RIPA裂解液；按1∶50比例加入蛋白酶抑制剂；冰上摇晃20 s，用细胞刮子将细胞刮下，将液体和细胞转移至1.5 mL EP管中；冰上使用超声破碎仪，超声粉碎10 s；15 000×、4 ℃离心10 min，将上清移至新EP管。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将各组蛋白配制成2 μg/μL上样缓冲液，100 ℃金属浴20 min，使蛋白变性，-80 ℃保存。配制丙烯酰胺胶，每孔加30 μg样品；80 V电泳30 min，100 V电泳120 min；用0.22 μm PVDF膜，200 mA、4 ℃湿转90 min；用5%脱脂牛奶（TBST配制）室温封闭1 h；按1∶1000稀释PINK1、Parkin、LC3、p62，按1∶5000稀释β-actin，4 ℃摇床孵育过夜；吸弃一抗，用TBST洗3次，每次10 min；按1∶10 000稀释二抗，37 ℃摇床孵育1 h；吸弃二抗，TBST洗3次，每次10 min，按1∶1配制显影液，用凝胶成像仪成像分析。

3 统计学方法

4 结果

4.1 芍药苷对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响

SH-SY5Y细胞存活率受H2O2浓度及作用时间的影响，H2O2浓度越高、作用时间越长，SH-SY5Y细胞存活率越低。当H2O2浓度为250 μmol/L、作用时间为24 h时，细胞存活率约为55%[9]，故本实验选择250 μmol/L H2O2诱导24 h建立细胞模型。给予不同浓度芍药苷干预24 h后，MTT结果显示，随着芍药苷浓度升高并不影响正常细胞的存活率，但浓度为40 μmol/L时会一定程度上影响细胞存活率，见表1。对250 μmol/L H2O2造模的细胞给予不同浓度芍药苷干预后，SH-SY5Y细胞存活率明显上升（＜0.05），且有一定的浓度相关性，见表2。根据MTT检测结果，选择低（5 μmol/L）、中（10 μmol/L）、高（20 μmol/L）3个浓度芍药苷进行后续实验。

表1 不同浓度芍药苷对SH-SY5Y细胞存活率的影响（±s）

表2 不同浓度芍药苷对H2O2作用SH-SY5Y细胞存活率的影响（±s）

注：与空白组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

4.2 芍药苷对过氧化氢诱导的SH-SY5Y线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期一个重要的标志性事件。JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可反映细胞膜电位的下降，同时也可将这一转变作为细胞凋亡早期的检测指标。当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，形成红色荧光；而当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，形成绿色荧光。通过JC-1荧光探针检测各组细胞线粒体膜电位，结果显示，空白组红色荧光较强，提示线粒体膜电位较高；与空白组比较，模型组绿色荧光与红色荧光比值明显升高，差异有统计学意义（＜0.05），提示模型组细胞线粒体膜电位下降；与模型组比较，芍药苷各剂量组绿色荧光与红色荧光比值降低，提示细胞线粒体膜电位较模型组升高，其中芍药苷中、高剂量组线粒体膜电位差异有统计学意义（＜0.05）。见图1、表3。

4.3 芍药苷对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

细胞发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。当基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上绿色荧光探针荧光素标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，从而可通过荧光显微镜进行检测。结果显示，与空白组比较，模型组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，芍药苷各剂量组细胞凋亡率均降低，芍药苷中、高剂量组差异有统计学意义（＜0.05）。结果见表4、图2。

4.4 芍药苷对过氧化氢诱导的SH-SY5Y线粒体自噬相关蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组细胞PINK1、p62和LC3Ⅱ蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，芍药苷各剂量组细胞PINK1、LC3Ⅱ和p62蛋白表达降低，Parkin蛋白表达升高，芍药苷高剂量组差异有统计学意义（＜0.05）。结果见表5、图3。

图1 各组SH-SY5Y线粒体膜电位比较（JC-1荧光探针，×200）

表3 各组SH-SY5Y线粒体膜电位比较（±s）

注：与空白组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

表4 各组SH-SY5Y细胞凋亡率比较（±s）

注：与空白组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

图2 各组SH-SY5Y细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×100）

表5 各组SH-SY5Y p62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，*＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

注：A.空白组；B.模型组；C.芍药苷低剂量组；D.芍药苷中剂量组；E.芍药苷高剂量组

5 讨论

有研究表明，芍药苷可改善AD脑内神经炎症与抑制核因子-κB向核的转运和促炎症因子的转录有关[10]，还可抑制AD转基因小鼠Aβ负荷、Aβ诱导的星形胶质细胞和小胶质细胞的过度激活[11]。另外，芍药苷还可减轻H2O2诱导的细胞氧化损伤作用，与JAK2/STAT3和ERK1/2信号通路有关[12]。前期研究结果显示，大量ROS在细胞内聚集会导致细胞损伤[13]。严重的氧化应激损伤可引发细胞内程序性死亡，导致细胞凋亡甚至死亡[14]。AD早期存在线粒体功能紊乱，线粒体功能紊乱会导致细胞代谢、钙离子平衡失调，同时也会导致氧化应激增多，最终导致细胞凋亡[12]。线粒体功能异常，以及相关的氧化应激改变是AD患者大脑中神经元受损最早出现且最突出的特征[15-16]。此外，研究表明，AD患者成纤维细胞在损伤后线粒体膜电位恢复较慢，溶酶体和自噬途径发生改变，ROS聚集，这些改变可通过Parkin的过表达来挽救[17]，但其在神经细胞中的改变及机制仍需进一步阐明。本实验结果显示，芍药苷可恢复H2O2诱导的SH-SY5Y线粒体膜电位下降，改善线粒体的功能； TUNEL染色结果显示，芍药苷可抑制SH-SY5Y细胞凋亡，对改善先于Aβ沉积及NFTs的形成之前就存在的氧化应激对细胞造成的影响具有重要意义。此外，线粒体膜电位的丧失可作为线粒体自噬的线索[18]。H2O2损伤的SH-SY5Y细胞自噬溶酶体功能受损，而芍药苷可促进其自噬溶酶体的形成，改善自噬受损。线粒体膜电位降低虽能激活线粒体自噬，但我们认为，氧化损伤条件下的SH-SY5Y细胞自噬溶酶体功能受损可能影响线粒体自噬，阻碍受损线粒体的降解过程。

线粒体自噬在AD受损线粒体的降解中起重要作用[19-20]，自噬溶酶体系统功能异常导致受损线粒体降解不足[21]；反之，线粒体功能障碍也可能损害该途径。PINK1是一种线粒体的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，对线粒体功能障碍和细胞凋亡具有保护作用[22-23]。Parkin是一种胞质的E3泛素连接酶，在线粒体的降解中起重要作用。PINK1与Parkin相互作用是线粒体质量控制的基础[24]，线粒体电位丧失可激活线粒体自噬[25-26]。当线粒体膜电位降低后，PINK1会积累在线粒体外膜上[27]，随后将Parkin募集到线粒体外膜，泛素化存在于线粒体膜中的Mfn2蛋白，防止受损的线粒体与健康的线粒体融合，最终通过p62蛋白与LC3结合，使线粒体降解。本研究结果表明，芍药苷干预后，H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤Parkin表达升高，PINK1、LC3Ⅱ、p62表达降低。此外，本课题组前期实验结果也表明，芍药苷可通过降低LC3Ⅱ表达，促进p62蛋白降解而调节H2O2损伤后SH-SY5Y细胞自噬水平。因此，我们认为，H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤PINK1表达升高是因为该蛋白在细胞内蓄积，并非合成增多；芍药苷对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，是通过提高Parkin的表达水平来促进PINK1将Parkin募集到受损的线粒体，促进受损线粒体的降解。因此，PINK1水平降低，Parkin水平升高。

本研究使用H2O2诱导SH-SY5Y为细胞模型，通过MTT法确定细胞损伤的适宜浓度与时间点确定模型条件[9]。结果显示，H2O2浓度为250 μmol/L、作用时间为24 h时，细胞存活率约为55%，该浓度下细胞线粒体膜电位降低，细胞凋亡率增加。芍药苷干预后，细胞线粒体膜电位有所恢复，细胞凋亡得以抑制，Parkin表达升高，PINK1、LC3Ⅱ和p62表达降低；提示芍药苷对SH-SY5Y氧化应激损伤有治疗作用。因此，我们认为，芍药苷可降低H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤，通过过表达Parkin蛋白，促进PINK1与Parkin的结合来调控线粒体自噬，恢复线粒体膜电位，抑制细胞凋亡，改善细胞受损状态。

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Effects of Paeoniflorin on PINK1-Parkin Mediated Mitophagy in H2O2-induced SH-SY5Y Cell Damage

YU Jingping, HE Chunxiang, LI Ze, YANG Miao, CHENG Shaowu, SONG Zhenyan

To explore the regulatory effects of paeoniflorin on mitophagy in H2O2-induced SH-SY5Y cell damage; To discuss its mechanism of action.250 μmol/L H2O2was used to induce SH-SY5Y for 24 h to construct a cell injury model. The blank group, model group and paeoniflorin low-, medium- and high-dosage groups were involved in the experiment. Methyl thiazolyl tetrazolium assay was used to detect cell survival rate. JC-1 mitochondrial membrane potential fluorescent probe was used to detect mitochondrial membrane potential. TUNEL staining was used to detect apoptosis rate. Western blot was adopted to detect the protein expression levels of PINK1, Parkin, LC3Ⅱ and p62.Compared with the blank group, the cell survival rate of the model group decreased; the mitochondrial membrane potential decreased; the apoptosis rate increased; the expressions of PINK1, LC3Ⅱ and p62 protein increased; the expression of Parkin protein did not change significantly. Compared withmodel group, the mitochondrial membrane potential of paeoniflorin low-, medium- and high-dosage groups increased; the apoptosis rate decreased; the expressions of PINK1, LC3Ⅱ and p62 proteindecreased;the expression of Parkin proteinincreased.Paeoniflorin can significantly reduce H2O2-induced SH-SY5Y cell damage, and the mechanism of action may be related to the regulation of PINK1-Parkin-mediated mitophagy pathway.

paeoniflorin; SH-SY5Y; hydrogen peroxide; mitochondrial autophagy; PINK1; Parkin; signal pathway

R285.5

A

1005-5304(2020)11-0045-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004479

国家自然科学基金面上项目（81774129）；湖南省自然科学基金（2018JJ2296、2019JJ50441）；湖南省中医药管理局科研项目（2018025）；湖南省教育厅优秀青年科研项目（18B246）

宋祯彦，E-mail：songzhenyan2013@hnucm.edu.cn

（2020-04-20）

（2020-04-29；编辑：华强）