加味独活寄生合剂对膝骨关节炎肝肾亏虚证患者血清代谢组学影响

邝涛，张易，沈浮，卢敏，邝高艳，黄惠勇

论著·临床研究

加味独活寄生合剂对膝骨关节炎肝肾亏虚证患者血清代谢组学影响

邝涛1，张易1，沈浮1，卢敏1，邝高艳1，黄惠勇2

1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208

采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的代谢组学方法，探讨加味独活寄生合剂对膝骨关节炎（KOA）肝肾亏虚证的疗效机制。选择25名KOA肝肾亏虚证患者，予加味独活寄生合剂，62.5 mL/次，2次/d，口服，7 d为1个疗程，共4个疗程。采用GC-MS检测患者治疗前后血清，并进行多元统计分析。患者治疗后血清中乳酸、丙氨酸、甘油、琥珀酸、葡萄糖、花生四烯酸含量明显降低，氨基丙二酸、苏氨酸、脯氨酸、肌醇含量明显上升（＜0.05）；寻找到三羧酸循环、甘油酯代谢、花生四烯酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、磷酸肌醇代谢等主要代谢通路对代谢物的回调发挥了重要作用。加味独活寄生合剂可能通过调控机体能量代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等途径缓解KOA肝肾亏虚证患者关节肿痛，实现治疗效果。

加味独活寄生合剂；膝骨关节炎；肝肾亏虚证；血清代谢组学；能量代谢；氨基酸代谢；脂质代谢

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见于中老年人的慢性疾病，目前西医治疗多以非甾体抗炎药、关节腔注射、理疗及人工关节置换手术为主[1-2]。中医学认为，中老年人易气血失和、肝肾亏虚，故临床上多采用补益肝肾、调和气血、强筋健骨及通痹止痛进行治疗[3]。加味独活寄生合剂是以《备急千金要方》独活寄生汤为基础，结合湖南中医药大学第一附属医院重点专科骨伤名老专家多年临床经验加味而成的院内制剂[4]。当前对加味独活寄生合剂治疗KOA的研究主要集中于临床疗效评价[5-6]，对其作用机制缺少深入研究。

代谢组学从整体观角度考察中药复方疗效，从生物标志物及代谢通路层面考察中药复方作用机制，与传统研究手段相比，代谢组学技术更适合中药复方的药效及作用机制研究[7]。气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）因其灵敏度高及具有已知数据库，深受研究人员青睐，常用于中医证候客观化研究[8]。本研究采用GC-MS代谢组学技术检测KOA患者经加味独活寄生合剂治疗后血清代谢组学变化，从代谢角度探讨加味独活寄生合剂治疗KOA的作用机制，为临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1－12月湖南中医药大学第一附属医院住院或门诊KOA患者25例。其中，男性10例，年龄42～70岁，病程1～5年；女性15例，年龄40～66岁，病程0.5～6年。本研究采用自身前后对照方法，将KOA患者药物干预前血清作为对照组，干预后血清作为药物组进行比较。本研究经湖南中医药大学第一附属医院临床伦理委员会审查批准（HN-LL-KY-2018-003-02）。

1.2 西医诊断标准

参照《骨关节炎诊断及治疗指南》[9]制定KOA西医诊断标准。①近1个月内反复膝关节疼痛；②X线片（站立或负重位）示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和/或囊性变、关节缘骨赘形成；③关节液（至少2次）清亮、黏稠，白细胞＜2000个/mL；④中老年患者（≥40岁）；⑤晨僵时间≤30 min；⑥活动时有骨摩擦音/感。综合临床、实验室及X线检查，符合①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可明确诊断。

1.3 中医辨证标准

参照《膝骨关节炎中医诊疗专家共识（2015年版）》[10]制定肝肾亏虚辨证标准。主症：膝关节疼痛，双腿无力、酸软，甚则关节肿大，活动受限；次症：头昏耳鸣，无力、畏寒，肢体肌肉不荣；舌脉：舌苔薄或薄白，舌红，脉弦细。

1.4 纳入标准

①符合上述西医诊断标准及中医辨证标准；②膝关节疼痛、肿胀处于发作期；③年龄40～80岁；④近1个月未服用任何皮质激素类药物；⑤患者对本研究知情，并签署知情同意书。

1.5 排除标准

①因创伤等其他原因导致的关节炎；②治疗过程中出现严重不良反应；③治疗过程中服用其他药物；④有精神障碍或重大疾病。

1.6 治疗方法

加味独活寄生合剂：独活6 g，桑寄生18 g，制天南星6 g，黄芩6 g，木瓜12 g，威灵仙12 g，杜仲12 g，牛膝6 g，细辛3 g，秦艽6 g，茯苓12 g，肉桂3 g，防风6 g，川芎6 g，党参12 g，甘草3 g，当归12 g，白芍10 g，熟地黄15 g。湖南中医药大学第一附属医院中药房根据药物制剂标准流程制作，批号201801。62.5 mL/次，2次/d，口服。7 d为1个疗程，共4个疗程。

1.7 仪器与试剂

GC-MS-QP2010气相色谱-质谱联用仪（日本岛津）。甲氧胺（BCBP2843V）、N,O-双（三甲基硅烷基乙酰胺）三氟乙酰胺（BSTFA，批号TS-38829）、吡啶（STBF305V）、苹果酸（04027AEV）、2-异丙基苹果酸（04027AEV）、脲酶（MFCD00070858）均购于Sigma公司。

1.8 血清样本采集及处理

收集患者治疗前后空腹静脉血5 mL，1000 r/min离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存，待全部样本收集后统一检测。血清样本前处理：样本于4 ℃下解冻1 h，取100 μL样本，加入50 μL内标（1 mg/mL 2-异丙基苹果酸甲醇溶液），涡旋混合；加450 μL甲醇除蛋白，涡旋混合后，静置8 min，13 000 r/min离心10 min，取上清液400 μL，氮气温和吹干。向干燥残渣中加入50 μL甲氧胺-吡啶（20 mg/mL），70 ℃反应1 h。再加入100 μL BSTFA，混匀30 s，70 ℃反应1 h，室温冷却，样品于1300 r/min离心8 min，取上清液100 μL移至250 μL内插管，装入进样瓶用于GC-MS分析检测[11]。

1.9 气相色谱-质谱联用技术数据采集与统计分析

色谱柱为DB-5 MS石英毛细管（0.25 mm×30 mm，0.25 m）。进样量1 μL，载气为氦气（99.99%），流速1 mL/min，分流比10∶1。柱温70 ℃保持4 min后，以20 ℃/min升温至110 ℃，再以8 ℃/min升温至270 ℃，保持5 min，进样口温度275 ℃，电子击离子源温度200 ℃，溶剂延迟时间6.0 min，质谱扫描范围35～550 m/z。

所有样本经GC-MS检测后，得总离子流色谱图，利用XCMS软件对采集到的谱图进行峰识别、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作，将结果转化为化合物的保留时间和峰面积信息，导入SMICA14.0统计软件进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。根据变量重要性投影（VIP）＞1筛选差异代谢物，利用SPSS21.0统计软件进行检验，＜0.05表示差异有统计学意义。采用Metabo Analyst（http://www.metaboanalyst.ca）进行代谢通路分析。

2 结果

2.1 气相色谱-质谱联用技术图谱与代谢物质指认

对照组和药物组血清样本进行GC-MS分析，得到典型总离子流色谱图（见图1）。经自动质谱去卷积鉴定系统对总离子流色谱图进行噪声处理、基线校正，对其中相似度＞70%的化合物进行鉴定（见表1）。

2.2 组间代谢差异分析

PCA是一种无监督的模式识别分析方法，可在多维空间对样本间差异进行直观显示。在PCA模型中，对照组和药物组的代谢表型有一定区分，说明二者血清代谢指纹存在差异（见图2a）。为了更好地对二者血清代谢谱进行分型，需借助多变量模式识别方法。PLS-DA是一种有监督的模式识别方法，通过建立类别间的数学模型，使样本间达到最大分离。建立的模型解释能力参数R2Y、预测能力参数Q2分别为0.976、0.924，说明该模型的区分程度和预测程度均较好（见图2b）。由图2c可知，药物组和对照组分布于得分图两侧，表明经药物干预后机体代谢存在一定变化。为验证模型准确度，采用20个置换的置换检验，拟合度参数R2＝0.321和Q2＝-0.283均符合要求，进一步说明了模型可靠性（见图2d）。

图1 KOA患者血清样本总离子流色谱图

表1 KOA患者血清样本中主要差异代谢物

序号tR/min化合物名称变化趋势VIP相似度/% 16.774丙酸 0.4091 26.925乳酸↓1.63*96 37.281醋酸 0.2883 47.431缬氨酸 0.1796 57.659丙氨酸↓1.70*93 67.967丁酸 0.2393 78.209乙二酸 0.6282 88.5173-羟基丁酸 0.3587 98.856异亮氨酸 0.1587 109.4202-酮异丙酸 0.5578 119.547苯乙酸 0.2992 129.899尿素 0.8793 1310.077丝氨酸 0.3690 1410.305甘油↓1.83*85 1510.673苏氨酸↑1.96*92 1610.830甘氨酸 0.5192 1711.143琥珀酸↓1.88*82 1811.708延胡索素 0.4478 1913.493氨基丙二酸↑1.24*71 2014.460脯氨酸↑1.66*94 2114.864核糖酸 0.5782 2218.6971,2,3-丙酸 0.5183 2319.123d-四氟红糖 0.8385 2419.374D-果糖 0.9788 2519.571甘露糖 0.3991 2619.737半乳糖 0.7387 2719.990葡萄糖↓1.85*92 2820.129葡萄糖酸 0.6186 2920.794β-半乳吡喃糖 0.2183 3021.841十五烷酸 0.4896 3122.249肌醇↑1.78*88 3223.8549,12-十八二烯酸 0.2387 3323.919油酸 0.5390 3424.224十八酸 0.7496 3526.002花生四烯酸↓1.23*84 3628.205十六酸 0.5592

注：与对照组比较，*＜0.05；↑.含量增加；↓.含量减少

注：绿色为药物组，蓝色为对照组

2.3 潜在代谢标志物确定

为筛选组间代谢差异物，采用OPLS-DA进行差异分析。OPLS-DA在PLS-DA的基础上进一步对数据进行正交处理，通过消除组间误差和随机误差，提高模型对数据的解析能力。根据OPLS-DA模型的VIP值来筛选差异代谢物，并进行显著性检验，符合VIP＞1且＜0.05的变量被认为与KOA有潜在关联（见图3）。通过HMDB数据库对变量结构进行鉴定，各代谢物VIP值见表1。可见，KOA患者经加味独活寄生合剂干预后，血清中乳酸、丙氨酸、甘油、琥珀酸、葡萄糖、花生四烯酸含量显著降低，氨基丙二酸、苏氨酸、脯氨酸及肌醇含量显著增加（＜0.05）。

图3 差异性标志物VIP值

2.4 代谢通路分析

差异代谢物变化常与病理条件下代谢网络的异常息息相关，通过分析通路可阐述药物作用机理。将鉴定所得到的血清差异代谢物进行代谢通路富集分析，见图4。分析代谢通路可知，共涉及半乳糖代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，丁酸代谢，丙酮酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，氨酰tRNA生物合成等20条代谢途径，将≤0.05且Pathway Impact＞0.1的代谢途径作为最重要的代谢途径，共5条：三羧酸循环（cirate cycle）、甘油酯代谢（glyceride metabolism）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）、淀粉和蔗糖代谢（starch and sucrose metabolism）、磷酸肌醇代谢（inositol phosphate metabolism）。

注：圆圈对应相关通路；圆圈颜色代表P值，P值越小，颜色越深；圆圈面积代表Pathway Impact，其值越大，面积越大

3 讨论

KOA病因复杂，肥胖、炎症、内分泌异常、免疫异常等多种因素均与其有关。本研究从代谢水平分析了加味独活寄生合剂对KOA的疗效，通过对患者血液代谢状况进行初步探索，寻找到与该状态密切相关的5条代谢途径，主要集中于能量代谢、氨基酸代谢及脂质代谢。

3.1 能量代谢

膝关节软骨、膝关节滑膜、软骨下骨三者在力学和生物学因素共同作用下，存在降解和合成平衡[12]。随着炎症细胞增加，平衡被打破，引起红肿、疼痛等一系列症状；而炎症因子的增加能促进滑膜炎症、骨性关节炎软骨降解，抑制蛋白聚糖、软骨胶原等合成，刺激破骨细胞活性，抑制骨细胞活性[13-14]。

炎症因子通过抑制胰岛素信号和糖酵解途径的激活，提高血糖水平[15]。血糖升高导致外周组织胰岛素抵抗及胰岛功能减退，从而抑制软骨细胞胶原合成，刺激细胞内质网应激，导致软骨降解、退化，加速滑膜炎症[16]。经加味独活寄生合剂治疗后，患者体内葡萄糖含量明显降低。在炎症损伤过程中，氧化酶由于活性下降，机体不完全氧化导致炎症中心乳酸不断积累。同时乳酸作为细胞转化和自身抗原性发展的致病因子，当机体浓度升高时，生物体会出现酸中毒，从而诱发炎症，导致软骨细胞肥大[17]。

随着炎症因子代谢增强，机体呼吸负荷增加，导致丙酮酸代谢和三羧酸循环异常[18]。酒石酸和氨基丙二酸是丙二酸的产物，丙二酸作为竞争性抑制剂可作用于呼吸电子传输链中的琥珀酸脱氢酶，从而介导三羧酸循环[19]。经加味独活寄生合剂治疗后，患者血液中氨基丙二酸出现一定回调，表明药物治疗可缓解KOA能量代谢异常。

有研究表明，参与三羧酸循环的绝大多数酶位于软骨细胞线粒体中，随着关节炎加重，线粒体功能出现障碍，导致代谢紊乱和三羧酸循环中间产物异常[20]。琥珀酸为三羧酸循环的中间产物，是先天免疫信号的代谢物，在炎症发生时可通过缺氧诱导因子1α提高白细胞介素-1β产量，放大炎症效应[21]。经药物干预后，琥珀酸含量在血液和尿液中含量均减少。但分析尿液中柠檬酸含量发现，经药物干预后，柠檬酸含量升高[22]。作为三羧酸循环的一部分，柠檬酸代谢不仅为机体活动提供能量，还可在不同浓度下影响钙晶体溶解度，抑制钙晶体形成[23-25]。结合前人研究我们推断，柠檬酸通过上调Ⅱ型胶原和骨化相关基因的表达，抑制钙晶体的形成和生长。

3.2 氨基酸代谢

机体代谢是一个复杂、整体的生物过程，糖、脂肪、氨基酸可通过不同代谢途径实现转换，如丙氨酸可通过丙氨酸-葡萄糖循环，参与乳酸-葡萄糖循环，随后进入三羧酸循环调节能量代谢，因此丙氨酸异常可提示氨基酸异常[26]。苏氨酸是生酮氨基酸，与氨基酸代谢障碍关系密切，且苏氨酸是免疫球蛋白中的一种必需氨基酸，在维持机体非特异性免疫屏障的完整中发挥重要功能[27]。精氨酸作为免疫调节剂，对机体炎症的抑制至关重要，研究表明，精氨酸不仅可通过一氧化氮代谢途径增强机体免疫能力，还能调节蛋白激酶信号通路抑制促炎基因表达[28-29]。脯氨酸可通过氨基酸代谢途径与精氨酸进行转化，提高免疫调节能力[30]。同时，脯氨酸是生物体内天然渗透压调节剂，对维持细胞膜稳定及提高骨细胞活性起重要作用[31]。分析给药前后氨基酸变化，经药物干预后，苏氨酸、脯氨酸含量升高，抑制炎症反应，增强机体免疫能力。

3.3 脂质代谢

甘油是三酰甘油（脂肪和油脂）和磷脂的重要组成部分，可被肝脏转化为葡萄糖，为细胞代谢提供能量[32]。炎症因子又抑制胰岛素信号和糖酵解途径的激活，促使脂肪动员加速，由三酰甘油形成的甘油充当第二信使发挥作用，而甘油水平升高又进一步诱导炎症因子产生，加速病情进展[33]。花生四烯酸是人体必需脂肪酸，在脂加氧酶及脱水酶的作用下生成大量白三烯，参与炎症反应[34-35]。肌醇在PI3K/AKT通路中起重要作用，通过抑制AKT激活起到抑制细胞增殖，从而改善炎症[36]。本研究显示，经加味独活寄生合剂干预后，患者体内甘油、花生四烯酸含量明显减少，肌醇含量增加。

综上所述，本研究基于GC-MS代谢组学技术，从患者血清内源性代谢物角度，结合代谢通路调控系统分析了加味独活寄生合剂治疗KOA的作用机理。从血清中共筛选出10个主要的潜在生物标志物，其变化参与了机体能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢。经加味独活寄生合剂治疗后，机体乳酸、丙氨酸、甘油、琥珀酸、葡萄糖、花生四烯酸含量显著降低，氨基丙二酸、苏氨酸、脯氨酸、肌醇含量显著增加。表明加味独活寄生合剂对KOA的代谢紊乱具有一定调节作用，可为加味独活寄生合剂在临床应用和药品研发提供理论依据。

本研究基于GC-MS考察KOA患者血清代谢变化，存在一定的局限性，在后续研究中应结合多种分析技术手段，如液相色谱-质谱、核磁共振等，增加样本量，整合蛋白组学、转录组学、基因组学等多组学技术对加味独活寄生合剂对KOA的疗效机制进行更深入研究。

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Study on Serum Metabolomics of Knee Osteoarthritis with Liver-kidney Deficiency Syndrome Intervened byMixture

KUANG Tao1, ZHANG Yi1, SHEN Fu1, LU Min1, KUANG Gaoyan1, HUANG Huiyong2

To explore the mechanism ofMixture on knee osteoarthritis (KOA) with liver-kidney deficiency syndrome by GC-MS metabolomics methods.Totally 25 patients of KOA with liver-kidney deficiency syndrome were randomly selected and treated withMixture, 62.5 mL/time, twice a day, 7 days a course, 4 courses for oral administration. The serum of the patients before and after treatment was detected by GC-MS and the metabolic data were analyzed by multivariate statistical analysis.After the treatment ofMixture, the contents of lactate, alanine, glycerin, succinic acid, glucose and arachidonic acid in serum were significantly reduced (<0.05), and the contents of amino malonic acid, threonine, proline and inositol significantly increased (<0.05). It was found that the main metabolic pathways, such as tricarboxylic acid cycle, glyceride metabolism, arachidonic acid metabolism, starch and sucrose metabolism, inositol phosphate metabolism and so on, played an important role in the recovery of metabolites.Mixture can alleviate the joint swelling and pain of patients of KOA with liver-kidney deficiency syndrome by regulating energy metabolism, amino acid metabolism and lipid metabolism to achieve efficacy.

Mixture; knee osteoarthritis; liver-kidney deficiency syndrome; serum metabolomics; energy metabolism; amino acid metabolism; lipid metabolism

R274.94

A

1005-5304(2020)11-0023-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004087

国家自然科学基金（81874476）；国家重点研发计划（2018YFC2002500）；第六批全国名老中医药专家学术经验继承项目（rsk-011-14）；湖南省自然科学基金（2018JJ2303、2019JJ50462）；湖南省科技厅创新项目（2017SK50302）；湖南省中医药科研计划（2015165）；湖南省卫生健康委科研计划（20200442）；湖南中医药大学校级课题（ZYYDX201726、2018XJJJ39）；湖南中医药大学中医学一流学科建设项目（2018ZYX61、2018ZYX63）

邝高艳，E-mail：kuangyi0109@126.com

（2020-04-03）

（2020-05-16；编辑：季巍巍）