血清miR-32-5p、miR-409-3p表达在宫颈癌诊断和预后中的临床价值

付芳华

上海中医药大学附属第七人民医院妇产科，上海 200137

宫颈癌是常见的女性肿瘤，在我国每年确诊病例达13万，占全球总数的28.8%，其发病率占女性肿瘤的第2位，且其发病率逐年升高，呈年轻化趋势[1]。部分宫颈癌的发生由子宫颈上皮内瘤变(CIN)转变而来，CIN疾病的监测、早期鉴别CIN和宫颈癌对提高宫颈癌的预后具有重要临床意义[2]。微小RNA(miRNA)是一种小分子非编码RNA，约有1/3的人类基因被miRNA调控，与mRNA结合后调控机体靶基因功能，是肿瘤辅助诊断、疾病监测和疗效评估的潜在肿瘤标志物。同时，由于血液中的miRNA十分稳定，经反复冻融和酸碱处理均能够稳定存在，故血清miRNA可用于监测肿瘤发生、发展和预后[3]。有研究证实，多种肿瘤患者血清中miR-32-5p、miR-409-3p等miRNA存在异常[4-5]，本研究通过检测宫颈癌患者血清miR-32-5p、miR-409-3p水平，观察其在宫颈癌诊断和预后中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2016年12月在本院行宫颈癌手术切除的患者112例为宫颈癌组，均行病理确诊，年龄35～79岁，平均(53.61±14.64)岁；肿瘤单发41例，多发71例；按照国际妇产科协会(FIGO)分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期33例，Ⅲ期32例和Ⅳ期22例。选择同期在本院就诊确诊为CIN的患者72例为CIN组，年龄32～79岁，平均(54.17±12.37)岁，其中CIN Ⅰ期31例，CIN Ⅱ期25例和CIN Ⅲ期16例。另选择同期在本院体检健康者45例为健康对照组，年龄34～79岁，平均(53.72±12.75)岁。研究对象均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核通过。排除标准：其他恶性肿瘤；炎症性、血液性和免疫性疾病；孕妇和哺乳期妇女；智力低下或精神障碍。3组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1血液标本保存与检测 在入组健康体检者体检时，以及患者入院后和手术后1周分别抽取肘静脉血2 mL。采用离心机将血液离心，离心半径15 cm，离心速度3 000 r/min，离心15 min，抽取上清液放置在除酶管内，置于-70 ℃冰箱中保存。血清人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、血清糖类抗原(CA)125标本采用酶联免疫吸附试验法检测。

1.2.2血清总RNA的提取和miRNA的检测 受试者血清400 μL，采用TaqMan miRNA试剂盒提取血清总RNA，反转录引物由上海化生有限公司合成。miR-409-3p上游引物序列：5′-GCG AAT GTT GCT CGG TGA-3′；下游引物序列：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。miR-32-5p上游引物序列：5′-GGA GAU AUU GCA CAU UAC UA-3′；下游引物序列：5′-UUA GUG UGU GUG AUA UUU UC-3′。U6上游引物序列：5′-GTG CTC CCT GCT TCG GCA GCA-3′；下游引物序列：5′-AAA AAT ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG-3′。

选择反转录酶1 μL、RNA 5 μL和3 μL引物，在15 μL的反应体系中，采用美国ABI TaqMan PreAmp Master Mix进行扩增，扩增条件为：在16 ℃ 30 min，42 ℃反应30 min和85 ℃反应5 min。反转录配制20 μL反应体系，放置在荧光定量仪中进行反应，反应条件为：95 ℃预变性为15 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，连续40个循环。每个样品检测3次，以2-ΔΔCt表示。

1.2.3观察指标 观察各组血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG和CA125水平的变化，以及血清miR-32-5p、miR-409-3p水平与临床指标、诊断和预后的关系。

2 结 果

2.13组血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG和CA125水平变化 宫颈癌组术前血清miR-32-5p、β-HCG水平明显高于CIN组和健康对照组(P<0.05)，CIN组明显高于健康对照组(P<0.05)，宫颈癌组术后血清miR-32-5p、β-HCG水平较术前明显降低(P<0.05)。宫颈癌组术前血清miR-409-3p水平明显低于CIN组和健康对照组(P<0.05)，CIN组明显低于健康对照组(P<0.05)，宫颈癌组术后血清miR-409-3p水平较术前明显升高(P<0.05)。宫颈癌组术前、CIN组、健康对照组血清CA125水平差异无统计学意义(P>0.05)。 见表1。

2.2血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG诊断宫颈癌的效能 血清miR-32-5p(P<0.05)和miR-409-3p(P<0.05)诊断宫颈癌的效能明显优于β-HCG(P<0.05)。将血清miR-32-5p和miR-409-3p水平进行二元Logistic回归，方程式为Y=1.480XmiR-32-5p-1.972XmiR-409-3p+0.187，miR-32-5p和miR-409-3p联合检测的灵敏度为84.8%，特异度为83.3%，曲线下面积(AUC)为0.916，明显高于miR-32-5p(P<0.05)和miR-409-3p(P<0.05)单项检测。 见表2。

表1 3组血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG和CA125水平变化

表2 血清miR-32-5p、miR-409-3p、β-HCG诊断宫颈癌的效能

2.3血清miR-32-5p、miR-409-3p与临床指标的关系 宫颈癌患者血清miR-32-5p、miR-409-3p与病理分级、淋巴结转移、淋巴血管浸润和FIGO分期具有相关性(P<0.05)，而与年龄、肿瘤直径和肿瘤数目无相关性(P>0.05)。 见表3。

2.4血清miR-32-5p、miR-409-3p与3年内出现死亡的关系 112例宫颈癌患者3年内死亡33例(死亡组)，存活79例(生存组)。生存组血清miR-32-5p水平明显低于死亡组(P<0.05)，而血清miR-409-3p水平明显高于死亡组(P<0.05)。见表4。

表3 血清miR-32-5p、miR-409-3p与临床指标的关系

2.5血清miR-32-5p、miR-409-3p预测宫颈癌3年内出现死亡的效能 血清miR-32-5p、miR-409-3p对预测宫颈癌3年内出现死亡具有较高的效能，2个指标经二元Logistic回归，方程式为Y=1.027XmiR-32-5p-3.691XmiR-409-3p+0.258，miR-32-5p和miR-409-3p联合检测的灵敏度为75.8%，特异度为93.7%；AUC为0.881，明显高于miR-32-5p(P<0.05)和miR-409-3p(P<0.05)单项检测。见表5。

表4 血清miR-32-5p、miR-409-3p与3年内出现死亡的关系

表5 血清miR-32-5p、miR-409-3p表达预测宫颈癌3年内出现死亡的效能

3 讨 论

miRNA是一类非编码小分子RNA，由于在血液中高度稳定，在反复冻融和酸碱等恶劣环境中仍然保持稳定，故已逐渐被运用到临床诊断和预后判断[6]。有研究证实，miRNA在宫颈癌的增殖、分化和凋亡等病理生理过程中具有重要作用，并且在判断预后方面具有重要临床意义[7]。本研究结果显示，宫颈癌组术前血清miR-32-5p水平明显高于CIN组和健康对照组，术后宫颈癌患者血清miR-32-5p水平明显降低，说明血清miR-32-5p与肿瘤组织具有相关性。本研究结果显示，当血清miR-32-5p>2.52时，其诊断宫颈癌的灵敏度为81.2%，特异度为79.2%，AUC为0.854，明显高于传统指标β-HCG的诊断效能，说明血清miR-32-5p对宫颈癌具有较高的诊断效能。本研究结果显示，血清miR-32-5p与病理分级、淋巴结转移、淋巴血管浸润和FIGO分期具有相关性，说明miR-32-5p参与了宫颈癌疾病的发生、发展过程，与文献报道一致[8]。已知miR-32-5p在多种肿瘤的发生、发展中具有重要作用，并且具有双重调节作用，在不同的肿瘤中可以是抑癌基因也可以是促癌基因[9-10]。在前列腺癌[4]和结肠癌[11]细胞的研究中证实其表达出现上调，并且与肿瘤的耐药性具有密切相关性，但其关于宫颈癌的研究鲜见报道。本研究随访发现，3年内出现死亡的患者血清miR-32-5p水平明显高于存活组患者，说明miR-32-5p与宫颈癌的预后具有密切相关性。本研究进一步发现，血清miR-32-5p预测3年内发生宫颈癌具有较高的预测效能，当血清miR-32-5p>4.17，其诊断宫颈癌的灵敏度为60.6%，特异度为89.9%，AUC为0.786，说明血清miR-32-5p对宫颈癌3年内出现死亡具有较高的预测价值，是宫颈癌预后的重要指标。

本研究结果显示，宫颈癌组术前血清miR-409-3p水平明显低于CIN组和健康对照组，术后宫颈癌患者血清miR-409-3p水平较术前明显升高，说明miR-409-3p是宫颈癌患者的保护基因，对癌症的发生、发展具有保护作用，与文献报道一致[12]。在诊断宫颈癌方面，血清miR-409-3p诊断宫颈癌的效能明显高于β-HCG，其灵敏度为92.0%，特异度为75.0%，AUC为0.817，并且其水平与病理分级、淋巴结转移、淋巴血管浸润和FIGO分期具有相关性，说明miR-409-3p具有抑制肿瘤发生、发展的作用，与肿瘤的生物学特性具有明显相关性。现已知miR-409-3p能够通过调节纤维蛋白原B水平和调节血管内皮或血管内皮生长因子来影响血管的生长和肿瘤的生长及转移[13-14]，此外，miR-409-3p还可以通过抑制血管素的表达从而抑制肿瘤血管的生成和新陈代谢[15]。在一项乳腺癌的研究中发现，miR-409-3p呈低表达，并且通过降低AKT1的基因表达，达到抑制肿瘤增殖和侵袭的效果[16]。本研究结果显示，宫颈癌患者随访3年，死亡组血清miR-409-3p水平明显低于存活组，说明血清miR-409-3p与宫颈癌预后具有重要联系。进一步分析与预后的关系发现，血清miR-409-3p≤1.24时，与3年内出现死亡具有相关性，其诊断宫颈癌的灵敏度为69.7%，特异度为86.1%，说明miR-409-3p是判断宫颈癌预后的重要指标。

本研究结果显示，miR-32-5p和miR-409-3p联合检测对宫颈癌具有更高的诊断效能，明显高于单项检测，其灵敏度为84.8%，特异度83.3%，其效能的提高可能与miR-32-5p和miR-409-3p之间具有互补性有关，miR-32-5p类似癌基因促进肿瘤的进展，而miR-409-3p类似抑癌基因抑制肿瘤的进展，当两者某种平衡打破后就可能出现肿瘤的增殖或者退缩，但其具体机制需要进一步研究。本研究结果还显示，在预测3年内出现死亡方面，miR-32-5p和miR-409-3p联合检测明显优于单项检测，其诊断宫颈癌的灵敏度为75.8%，特异度为93.7%，AUC为0.881，明显提高了诊断效能。故miR-32-5p和miR-409-3p联合检测不仅是诊断宫颈癌的重要指标，而且是预测预后的重要指标。