血清miR-139-5p、miR-146b-5p水平在乳腺癌诊断中的临床价值

唐志金，于海文，沈 华

上海嘉定区南翔医院普外科，上海 201802

乳腺癌是普外科常见肿瘤，其发病率逐年升高，严重威胁着女性的健康。其治疗方法主要有手术、化疗和放疗等，虽然治疗的疗效得到极大改善，但复发和转移仍然得不到有效控制，是导致死亡的重要原因。乳腺癌早诊断和早治疗是提高预后的关键，临床上对乳腺癌的诊断主要依靠B超、钼靶和CT等传统检查方式，仍然缺乏特异性的检测指标[1]。微小RNA(miRNA)是近年来发现的一类调控基因表达的小分子RNA，与肿瘤的发生、发展具有密切关系，是潜在的诊断和药物治疗的靶点，同时，血液中的miRNA具有稳定性好、可长期保存和耐降解等特点，是筛查和诊断肿瘤的潜在生物标志物[2]。有研究证实，血清miR-139-5p、miR-146b-5p在乳腺癌筛查中出现异常表达[3]。本研究通过对乳腺癌患者血清miR-139-5p、miR-146b-5p进行检测，观察其在乳腺癌早期诊断中的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2018年12月在本院诊治的乳腺癌患者117例为乳腺癌组，患者年龄39～79岁，平均(53.64±6.17)岁；病理类型：浸润型导管癌61例，浸润型小叶癌56例；TNM分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期43例，Ⅲ期42例；分化程度：低分化49例，中高分化68例。选择同期在本院就诊的乳腺纤维腺瘤患者75例为乳腺纤维腺瘤组，患者年龄42～79岁，平均(54.13±7.16)岁。选择同期在本院体检健康者45例为健康对照组，年龄40～79岁，平均(53.49±8.16)岁。纳入标准：乳腺癌、乳腺纤维腺瘤患者均经病理确诊。排除标准：(1)其他部位的恶性肿瘤；(2)术前经放疗或者化疗；(3)临床资料不全；(4)血液性和免疫性疾病；(5)智力障碍或者精神性疾病。3组研究者的年龄等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究者均知情同意并签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1血清标本留取和指标的检测 患者入院时和手术后1周分别抽取肘静脉血2 mL，放置于乙二胺四乙酸抗凝管中。采用离心机将血液离心，离心半径为15 cm，3 000 r/min离心15 min，抽取上清液放置于除酶管内，置-70 ℃冰箱中保存。血清糖类抗原(CA)153水平采用酶联免疫吸附试验法，使用瑞士罗氏公司生产的全自动电化学发光免疫分析仪E-170检测，测定试剂盒及质控品为仪器配套产品。

1.2.2实时荧光定量PCR(qPCR) 总RNA的提取：采用mirVana PARIS Kit(Ambion公司，美国)试剂盒提取和纯化miRNA，在血清200 μL中加入1 000 μL的溶解试剂，静置于室温下15 min，根据试剂盒说明书提取血清中的RNA，并用DEPC溶解总RNA。通过试剂盒将RNA反转录为cDNA，根据试剂盒One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit，将PCR参数设定为：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。qPCR：采用TaqMan®miRNA反转录试剂盒将提取的miRNA反转录成cDNA ，根据使用说明书配制20 μL的qPCR反应体系，并进行PCR的扩增。根据设计软件primer express 3.0合成qPCR检测引物探针。miR-139-5p上游引物序列：5′-CTC TGC TCT ACA GTG CAC GTG TC-3′；下游引物序列：5′-TAT GGT TGT TCT CGA CTC CTT CAC-3′。miR-146b-5p上游引物序列：5′-CAA CCT TGA GAA CTG AAT TCC ATA-3′；下游引物序列：5′-AAA GGT TGA TCT CGT CTC TCT GTC-3′。U6的上游引物序列：5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′；下游引物序列：5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。 采用Maxima SYBR Green qPCR Kit (Thermo scientific公司，美国)，根据试剂盒说明书，设计反应条件：95 ℃进行15 min的预变性，循环参数设置为94 ℃变性15 min，在55 ℃退火30 s，并在72 ℃延伸30 s，总共反应40个循环，根据溶解曲线设置荧光信号。以U6为内参[4]，结果以2-ΔΔCt表示相对表达值，其中ΔΔCt=(Ct实验组目的基因-Ct实验组U6)-(Ct对照组目的基因-Ct对照组U6)。

1.2.3观察指标 观察各组血清miR-139-5p、miR-146b-5p、CA153水平的变化及诊断效能。

2 结 果

2.13组血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平的变化 乳腺癌组术前血清miR-139-5p、CA153水平高于乳腺纤维腺瘤组(t=11.997、6.534，均P<0.001)和健康对照组(t=14.848、18.362，均P<0.001)，乳腺纤维腺瘤组明显高于健康对照组(t=3.406、32.505，均P<0.001)，乳腺癌组术后血清miR-139-5p、CA153水平较术前明显降低(t=15.667、17.540，均P<0.001)。乳腺癌组的术前血清miR-146b-5p水平明显低于乳腺纤维腺瘤组(t=10.937，P<0.001)和健康对照组(t=7.637，P<0.001)，乳腺纤维腺瘤组明显低于健康对照组(t=3.285，P=0.002)，乳腺癌组术后血清miR-146b-5p水平明显高于术前(t=17.540，P<0.001)。见表1。

表1 3组血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平的变化

2.2血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平在乳腺癌中的诊断效能 与CA153比较，血清miR-139-5p(P=0.001)和 miR-146b-5p(P=0.007)对乳腺癌具有更高的诊断效能。通过对miR-139-5p和 miR-146b-5p指标的Logistic回归分析得到方程Y=1.325XmiR-139-5p-1.334XmiR-146b-5p+1.281，miR-139-5p和 miR-146b-5p联合检测的灵敏度为86.6%，特异度为89.3%，曲线下面积(AUC)为0.930，明显高于miR-139-5p(P=0.006)和 miR-146b-5p(P=0.001)单项检测，而miR-139-5p与 miR-146b-5p比较差异无统计学意义(P=0.415)。见表2。

2.3乳腺癌血清miR-139-5p和miR-146b-5p水平的相互关系 乳腺癌血清miR-139-5p水平与miR-146b-5p水平呈负相关(r=-0.765，P<0.05)。

2.4血清miR-139-5p和miR-146b-5p水平与临床指标的相关性 血清miR-139-5p和miR-146b-5p水平与淋巴转移、TNM分期和分化程度具有明显相关性(P<0.05)，与年龄、肿瘤直径、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(HER-2)和病理类型无明显相关性(P>0.05)。见表3。

表2 血清miR-139-5p、miR-146b-5p和CA153水平对乳腺癌的诊断效能

表3 血清miR-139-5p、miR-146b-5p水平与临床指标的相关性

3 讨 论

随着对乳腺癌研究的深入，越来越多学者认为miRNA的表达在细胞生命活动信号转导调控中具有重要调控作用，可参与细胞增殖、分化和血管生成等生命活动过程。miRNA在血清等多种体液中具有不同程度表达，且表达相对稳定，多次冻融不易被分解，可以长期保存，同时具有以下特点[5-7]：(1)组织特异性，不同组织具有不同的miRNA，可以作为某一细胞的组织特异性标志物；(2)保守性，不同细胞或组织之间具有相同或者相似的miRNA序列；(3)时空特异性，不同发育阶段具有不同的miRNA表达；(4)执行一定的生物能力，对生命活动具有一定的调节作用。

本研究发现，乳腺癌患者术前血清miR-139-5p水平明显高于乳腺纤维腺瘤组和健康对照组，而乳腺纤维腺瘤组又明显高于健康对照组，乳腺癌组术后血清miR-139-5p水平较术前出现明显降低，说明miR-139-5p参与了乳腺癌的发生、发展过程。miR-139-5p在乳腺癌中的研究较少[8-9]，而在其他肿瘤如结肠癌、宫颈癌和甲状腺癌中有异常表达[10-12]。在结肠癌的研究中发现，miR-139-5p在癌组织较在正常组织表达明显下降，且与肿瘤的分期相关，上调能够显著抑制结肠癌的转移潜能和药物抵抗，促进肿瘤细胞的凋亡。在一项前列腺癌的研究中发现，miR-139-5p在肝癌组织中呈低表达，而在癌旁组织中呈高表达，在前列腺癌的研究中为抑癌基因[13]。而郑奋薇等[14]研究表明，前列腺癌复发组血清miR-139-5p水平明显高于未复发组，复发转移患者血清miR-139-5p水平与肿瘤分期、Gleason评分和血清前列腺特异抗原水平具有明显相关性，并认为血清miR-139-5p水平对预测前列腺癌复发和转移具有重要的临床价值。本研究中，miR-139-5p在乳腺癌中表现为癌基因的作用，并且其表达强度与淋巴转移、TNM分期和分化程度有明显相关性，而与年龄、肿瘤直径、ER、PR、HER-2和病理类型无明显相关性。本研究结果显示，当血清miR-139-5p>2.22，其灵敏度为89.3%，特异度为76.1%，AUC为0.873，AUC明显高于CA153的0.717，说明miR-139-5p对诊断乳腺癌具有更高的灵敏度和特异度。

本研究结果显示，乳腺癌组的术前血清miR-146b-5p水平明显低于乳腺纤维腺瘤组和健康对照组，乳腺纤维腺瘤组低于健康对照组，乳腺癌组术后血清miR-146b-5p水平明显高于术前，说明miR-146b-5p是乳腺癌的保护基因，与乳腺癌的发生、发展具有一定相关性。miR-146b-5p定位于染色体10q24-26，在不同的组织表达不同，肺、脾脏和胸腺中呈高表达，在非小细胞肺癌、结肠癌和胰腺癌中呈低表达[15-17]。有研究证实，miR-146可以通过调节白细胞介素和肿瘤坏死因子等抑制天然免疫反应[18]。在一项胰腺癌的研究中发现，miR-146b-5p在6株胰腺癌细胞株中呈低表达，而在正常胰腺组织中呈高表达[19]。本研究结果证实，血清miR-146b-5p水平与淋巴转移、TNM分期和分化程度有明显相关性，而与年龄、肿瘤直径、ER、PR、HER-2和病理类型无明显相关性，说明血清miR-146b-5p表达水平是预后的重要因素。本研究结果显示，当血清miR-146b-5p≤3.19，其灵敏度为92.3%，特异度为65.3%，AUC为0.842，AUC明显高于CA153的0.717，说明其对乳腺癌的诊断效能明显优于CA153。miR-139-5p和miR-146b-5p联合检测能够明显提高乳腺癌的诊断效能，其灵敏度为86.6%，特异度为89.3%，AUC为0.930。本研究结果显示，血清miR-139-5p与miR-146b-5p呈负相关，说明miR-139-5p和miR-146b-5p两者在诊断乳腺癌方面具有一定的互补性，miR-139-5p类似于癌基因，miR-146b-5p类似于抑癌基因，其具体机制需要进一步研究。

总之，miR-139-5p和miR-146b-5p参与了乳腺癌的发生、发展过程，对乳腺癌的诊断具有较高的灵敏度和特异度。