甲基硒酸对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制的研究

王晓庆 刘九月 姚光 孙玉梅

婴幼儿血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是婴幼儿最常见的皮肤良性肿瘤，其发病率约为4%～5%[1]。研究发现，女性、白种人、低体重早产儿和多胞胎的IH发病率较高[2]。IH发病机制较为复杂，其中IH早期内皮细胞快速增殖是其进展的重要因素。因此，抑制增殖期IH内皮细胞增殖，促进其凋亡，对IH防治意义重大。甲基硒酸是一种高效的第二代硒化合物，是最有效的体外化学预防剂。研究显示，甲基硒酸可抑制口腔鳞状细胞癌、肺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长[3-5]。此外，甲基硒酸可能通过上调miR-146a对食管鳞癌细胞产生明显的增殖抑制作用[6]。但甲基硒酸在IH中是否具有抗肿瘤作用尚未可知。miR-499a-5p是近年发现的微小RNA，上调miR-499a-5p对胶质瘤细胞的恶性生物学行为具有显著抑制作用[7]。但miR-499a-5p在IH中的作用尚未可知，本研究拟通过观察甲基硒酸对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡以及miR-499a-5p表达的影响，初步探讨其可能的分子机制，以期为IH的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

M199培养液(Gibco公司，美国)；甲基硒酸、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)；LipofectamineTM2000、Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)；miR-499a-5p模拟物miR-499a-5p mimics及其阴性对照miR-NC、抑制物anti-miR-499a-5p及其阴性对照anti-miR-NC(广州锐博生物技术公司)；MTT试剂盒、膜联蛋白-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(南京科元生物技术公司)；兔抗Cyclin D1抗体、鼠抗p21抗体、兔抗Bcl-2抗体、鼠抗Bax抗体、兔抗磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(上海碧云天生物技术研究所)；一步法miRNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)；SYBR Green master mix(大连宝生生物技术公司)。

选取2016年至2018年于我院整形外科进行手术的增殖期IH标本5例，均获患儿监护人知情同意。患儿年龄为3～14月龄；男2例，女3例。所有患儿均未接受其他针对性治疗。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染

参照文献[8]的方法，从新鲜IH标本中剥离单个瘤体，将瘤体剪碎，按照组织块间距3 mm置于培养瓶中，将培养瓶倒置，于37 ℃恒温箱中培养6 h，弃去上清液。加入2 mL的M199培养液(含20%胎牛血清、70 ptg/L生长因子使用液、100 μL/mL肝素)，然后分装于铺有明胶的25 mL培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2、湿润培养箱中孵育24 h后更换培养液，以后每周换液2～3次。培养30 d左右长成单层细胞，当细胞融合度达到90%时，胰酶消化传代。将对数生长期血管瘤内皮细胞制成5×104个/mL的单细胞悬液。取2 mL细胞悬液加入到6孔板，当细胞融合度达到50%时参照脂质体转染试剂LipofectamineTM2000说明书进行细胞转染。转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.2 实验分组

分别采用低、中、高浓度(2.5、5、10 μmol/L)的甲基硒酸作用于血管瘤内皮细胞24 h，依次标记为甲基硒酸低浓度(MSA-L)组、甲基硒酸中浓度(MSA-M)组、甲基硒酸高浓度(MSA-H)组，单纯血管瘤内皮细胞设为对照(Con)组。按照下述方法步骤检测细胞增殖抑制率、凋亡率、Cyclin D1(增殖相关蛋白)、p21(增殖相关蛋白)、Bcl-2(凋亡相关蛋白)、Bax(凋亡相关蛋白)以及miR-499a-5p的表达水平。

为验证甲基硒酸对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响与调控miR-499a-5p表达有关，将血管瘤内皮细胞分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-499a-5p组(转染miR-499a-5p mimics)、MSA+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC后，10 μmol/L的甲基硒酸作用24 h)、MSA+anti-miR-499a-5p组(转染anti-miR-499a-5p后，10 μmol/L的甲基硒酸作用24 h)。按照下述实验步骤检测细胞增殖、凋亡以及相关蛋白表达情况。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制率

取5×103个血管瘤内皮细胞接种96孔板，按照实验分组进行处理后，各孔中加入20 μL的MTT溶液(质量浓度为5 mg/mL)。4 h后移液枪吸去所有培养液，各孔中加入150 μL的二甲基亚砜溶液，旋涡振荡器振荡10 min溶解甲臜颗粒，酶标仪在490 nm处检测吸光度值。增殖抑制率=[(A对照孔-A实验孔)/(A对照孔-A空白孔)]×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

取1×105个血管瘤内皮细胞接种于6孔板，按照实验分组进行处理后，胰酶消化细胞制成单细胞悬液。用1×结合缓冲液洗涤细胞1次，1 000 r/min离心5 min收集细胞。加入200 μL的1×结合缓冲液重悬细胞，分别加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC、5 μL的碘化丙啶避光染色15 min，补加300 μL的1×结合缓冲液混匀后上机检测细胞凋亡情况。

1.2.5 Western-blot检测Cyclin D1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达

收集各组血管瘤内皮细胞，加入RIPA细胞裂解于冰上裂解15 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清液，测定蛋白浓度后-80 ℃保存备用。将适量蛋白与等体积1×上样缓冲液混匀，煮沸5 min后-20 ℃保存备用。配置浓缩胶、分离胶，上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，当溴酚蓝到达凝胶底部时终止电泳。湿法转膜后，用含5%的脱脂牛奶封闭液37 ℃封闭膜1 h。1∶500稀释一抗，4 ℃孵育膜过夜。1∶1 000稀释二抗，37 ℃下孵育1 h。洗膜后，加入化学发光试剂显色，凝胶成像系统对各目的条带进行灰度分析，以目的蛋白和GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.2.6 RT-qPCR检测miR-499a-5p表达水平

Trizol试剂从各组血管瘤内皮细胞中提取总RNA，一步法miRNA逆转录试剂盒合成cDNA。按照cDNA 2 μL、SYBR Green master mix 10 μL、引物1 μL、双蒸水6 μL配置20 μL反应体系，于实时PCR系统中进行扩增。2-ΔΔCt法分析miR-499a-5p的相对表达水平。引物序列：miR-499a-5p上游引物5′-ATGTAGCGTGCGACCG-3′，下游引物5′-CAGGC TGACGCACTCTGTGCT-3′；U6上游引物5′-CCATCGGAAGCTCGTATACGAAATT-3′，下游引物5′-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTCAG-3′。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞增殖的影响

如表1和图1所示，与Con组比较，MSA-L、MSA-M、MSA-H组血管瘤内皮细胞增殖抑制率、p21蛋白表达显著升高(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表达显著降低(P<0.05)，且MSA-L、MSA-M、MSA-H三组间上述各指标比较均差异显著(P<0.05)。

2.2 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞凋亡的影响

如表2与图2所示，与Con组比较，MSA-L、MSA-M、MSA-H组血管瘤内皮细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)，且MSA-L、MSA-M、MSA-H三组间上述各指标比较均差异显著(P<0.05)。

表1 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞增殖的影响Table 1 The effect of methylselenic acid on the proliferation of hemangioma endothelial cells

图1 Western-blot检测各组血管瘤内皮细胞增殖相关蛋白表达Fig. 1 The expression of proliferation-related proteins in heman-gioma endothelial cells detected by Western-blot

表2 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞凋亡的影响Table 2 The effect of methylselenic acid on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

2.3 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞中miR-499a-5p表达的影响

如表3所示，与Con组比较，MSA-L、MSA-M、MSA-H组血管瘤内皮细胞miR-499a-5p表达显著升高(P<0.05)，且MSA-L、MSA-M、MSA-H三组间miR-499a-5p的表达均差异显著(P<0.05)。

2.4 miR-499a-5p过表达对血管瘤内皮细胞增殖的影响

如表4和图3所示，与miR-NC组比较，miR-499a-5p组血管瘤内皮细胞miR-499a-5p表达、细胞增殖抑制率、p21蛋白表达显著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表达显著降低(P<0.05)。

2.5 miR-499a-5p过表达对血管瘤内皮细胞凋亡的影响

表5和图4显示，与miR-NC组比较，miR-499a-5p组血管瘤内皮细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。

A：Western-blot检测各组凋亡相关蛋白表达；B：流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况A: The expression of apoptosis-related protein in each group detected by Western-blot; B: Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry图2 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞凋亡的影响Fig. 2 The effect of methylselenic acid on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

表3 甲基硒酸对血管瘤内皮细胞中miR-499a-5p表达的影响Table 3 The effect of methylselenic acid on the expression of miR-499a-5p in hemangioma endothelial cells

表5 miR-499a-5p过表达对血管瘤内皮细胞凋亡的影响Table 5 The effect of miR-499a-5p overexpression on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

A：Western-blot检测各组凋亡相关蛋白表达；B：流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况A: The expression of apoptosis-related protein in each group detected by Western-blot; B: Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry图4 miR-499a-5p过表达对血管瘤内皮细胞凋亡的影响Fig. 4 The effect of miR-499a-5p overexpression on the apoptosis of hemangioma endothelial cells

2.6 抑制miR-499a-5p表达逆转了甲基硒酸(10 μmol/L)对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响

表6和图5显示，与MSA+anti-miR-NC组比较，MSA+anti-miR-499a-5p组血管瘤内皮细胞的miR-499a-5p表达显著降低(P<0.05)，细胞增殖抑制率、凋亡率、p21和Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)，Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。

表6 抑制miR-499a-5p表达逆转甲基硒酸对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的作用Table 6 The effect of methylselenate on the proliferation and apoptosis of hemangioma endothelial cells was reversed by miR-499a-5p inhibition

A：Western-blot检测各组增殖、凋亡相关蛋白表达；B：流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况A: The expression of proliferation and apoptosis-related protein in each group detected by Western-blot; B: Cell apoptosis in each group detected by flow cytometry图5 抑制miR-499a-5p表达逆转甲基硒酸对血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的作用Fig. 5 The effect of methylselenate on the proliferation and apoptosis of hemangioma endothelial cells was reversed by miR-499a-5p inhibition

3 讨论

IH是婴幼儿常见的血管肿瘤之一，尽管约10%的IH病例在1年内能自行消退，但90%的IH病例则需3～4年甚至更长时间才能退化[9]。IH常常伴有溃疡、瘢痕、出血等潜在并发症，可导致呼吸或视力损害甚至死亡[10]。因此，在早期阶段积极干预，促进IH自行消退对治疗具有重要意义。

硒元素缺乏是导致包括肿瘤在内的多种人类疾病发生的重要因素。甲基硒酸是一种有机硒衍生物，已被证实在人类肿瘤中具有显著的化学预防和治疗活性。Qiu等[11]的研究表明，甲基硒酸通过抑制Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)/信号转导与转录激活因子3(Signal transduction and transcription activator 3，STAT3)途径能够抑制乳腺癌体内移植瘤的生长。Tarrado-Castellarnau等[12]研究的显示，甲基硒酸处理可促进肺癌A549细胞DNA单链断裂，破坏肿瘤细胞代谢适应能力，诱导G1期细胞周期阻滞和细胞凋亡。此外，甲基硒酸还可促进血管内皮细胞的黏附，抑制其迁移和血管形成，提示甲基硒酸可能是临床抗肿瘤治疗的潜在候选或辅助药物[13]。与上述抗肿瘤作用一致，本研究显示甲基硒酸可抑制血管瘤内皮细胞增殖，诱导细胞凋亡，并呈明显的剂量依赖关系。Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡的重要蛋白，当Bax表达增加时，促进Bax/Bax同二聚体的形成，促进细胞凋亡发生，但Bcl-2表达增加则促进Bcl-2/Bax异二聚体形成从而发挥抗凋亡作用[14]。p21是细胞周期蛋白激酶(Cyclin dependent kinase，CDKs)抑制剂家族的重要成员，其通过抑制CDKs/Cyclin D1活性抑制DNA复制和修复，阻碍细胞周期进展，具有抗肿瘤作用[15]。本研究显示，甲基硒酸抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达，促进p21和Bax表达，且呈剂量依赖关系，与功能试验的结果相吻合。以上结果表明，甲基硒酸对IH具有显著的抗肿瘤作用。

miRNA是一类内源性非编码单链小分子RNA，其通过与靶基因3′非翻译区结合调控真核生物基因表达，参与调控细胞增殖、凋亡、迁移侵袭等多种生物学过程，在包括IH在内的肿瘤发生中具有重要作用[16]。例如，普萘洛尔通过下调miR-382抑制第10号染色体的磷酸酶和张力酶基因(Phos-phatase and tensin homologne derived from chromosome ten，PTEN)介导的蛋白激酶B(Protein kinase，AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路，抑制IH进展[17]。miR-499a-5p因具有抗肿瘤作用，在肿瘤研究中日益受到关注。骨肉瘤中miR-499a-5p表达降低，上调miR-499a-5p通过负调控Mg2+依赖性蛋白磷酸酶1δ(Protein phosphatase magnesium-dependent 1δ，PPM1D)可抑制骨肉瘤细胞的增殖和分化[18]。miR-499a-5p还可降低宫颈癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力，抑制其上皮间质转化，促进细胞凋亡，增强其放射敏感性[19]。本研究发现，甲基硒酸干预后血管瘤内皮细胞中miR-499a-5p表达显著升高，提示甲基硒酸的抗IH作用可能与上调miR-499a-5p表达有关。进一步研究发现，转染miR-499a-5p mimics上调miR-499a-5p表达亦可抑制血管瘤内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，与已有的报道甲基硒酸的抗肿瘤作用一致[11-12]。此外，本研究发现，抑制miR-499a-5p表达还可逆转甲基硒酸对血管瘤内皮细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，说明甲基硒酸在IH中的抗肿瘤作用可能与上调miR-499a-5p表达有关。

综上所述，甲基硒酸可能通过上调miR-499a-5p表达进而抑制血管瘤内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，这为甲基硒酸在IH防治中的应用提供了新的线索和依据。