三叶青多糖对人肝癌细胞凋亡诱导作用及机理研究

戴庆福 林玉梅 王玉霞 高珊珊 曹慧敏 陈开红

肝癌是人体常见的恶性肿瘤之一，位列消化道肿瘤死亡第一位。常规治疗以手术和放化疗为主，但不可避免的骨髓抑制、免疫力低下、胃肠道反应等毒副作用使得治疗难度加大。肝作为人体解毒器官，通过减少药物摄入量和降低药物的活性等方式来提升抗药性的研究，使得中医药治疗领域中，抗肿瘤药物为患者疾病治疗提供了新的路径[1]。三叶青即金线吊葫芦，最初用于治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等疾病，后在动物实验研究中，被纳入抗肿瘤常用药物中并取得了一定的成效。究其原因在于三叶青总氨基酸、多糖的含量之于肝癌细胞HepG2 信号转导途径的效果上[2]。本研究为三叶青多糖对人肝癌细胞凋亡诱导作用及机理，特选取2019 年4 月—2020 年3 月以来我院收治76 例肝癌患者的临床资料为样本勘验对象，现就具体实验结果总结分析如下。

1 基本资料和方法

1.1 基本资料

应用医学研究勘验对比法，选取2019 年4 月—2020 年3 月以来我院收治76 例肝癌患者的临床资料，按照介入治疗环节是否应用三叶青多糖，等分为对照组（未施用组，CTX 环磷酰胺）和试验组。其中对照组男21 岁，女17 岁，年龄在43～67 岁，平均年龄（55.01±0.11）岁, Zung 抑郁自评量表（SDS）测试患者抑郁情况，6 例中重度抑郁患者；治疗时间1～3 个月。试验组男20 岁，女18岁，年龄在44～66 岁，平均年龄（55.11±0.01）岁；Zung 抑郁自评量表（SDS）测试7 例中重度抑郁；治疗时间1～3 个月。两组患者临床资料在年龄、抑郁情况、基本家庭背景（中等收入，月人均工资3 000～4 000 元）、治疗时间（1～3 个月）上差异不明显，无统计学对比意义（P＞0.05）。

1.2 方法

临床实验和对比两组细胞凋亡有效率、Bcl-2、Bax 和Survivin蛋白表达结果及其PXR 受体调控的CYP3A 诱导作用结果。流式细胞仪分析细胞周期及凋亡率。具体步骤为：收集细胞[数目约（1～ 5）×106个/mL]，500～ 1 000 r/min 离心5 min，弃去培养液；细胞洗涤，3 mL PBS 洗涤1 次；乙醇固定；离心去PBS，加入冰预冷的70% 的乙醇固定，4℃，1～2 h；细胞重悬，离心弃去固定液，3 mL PBS 重悬5 min；细胞过滤400 目的筛网过滤1次，500～1 000 r/min 离心5 min，弃去PBS；染色；用1 mL PI 染液染色，4℃避光30 min；流式细胞仪检测；PI 用氩离子激发荧光，激光光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光分析PI 荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图；结果判断。免疫化学法检测Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白。石蜡切片脱蜡至水；3%H202室温孵育5 ～10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 min，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）；5%～10%正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育10 min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1 ～2 h 或4℃过夜；PBS冲洗，5 min×3 次；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA － PBS 稀释），37℃孵育10 ～30 min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10 ～30 min；PBS 冲洗，5 min×3 次；滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10 ～30 min；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10 ～30 min；PBS 冲洗，5 min×3次；显色剂显色（DAB 或AEC）；自来水充分冲洗，复染，封片。考察THP 对Bcl-2 表达/ 癌细胞凋亡的影响和Survivin 表达/ 癌细胞凋亡的影响；考察THP 对PXR 受体调控的CYP3A诱导作用，可半定量地评价THP 对肝脏降解致癌物及其他效应物功能的诱导作用。

1.3 观察指标[3]

细胞培养及倒置显微镜形态学观察；AO 染色及荧光显微镜形态学观察；MTT 法检测THP 对肿瘤细胞增殖抑制作用。细胞凋亡：染色后细胞核呈棕褐色的细胞被判为凋亡细胞；凋亡细胞染色质浓聚，通常沿核膜分布；整体细胞形态发生变化，如细胞表面微绒毛状突起消失，细胞间接触消失，细胞质浓聚，形成具有膜结构的包裹着胞浆内容物和核物质的凋亡小体；相比坏死，凋亡细胞的核结构直到晚期才会解体。

1.4 统计学方法

应用统计学软件包IBM SPSS Statistics 24.0（社会科学统计软件包）对研究数据进行统计分析，计数资料均用χ2检验，以%表示，其他计量资料比较均以（±s）表示，以t检验，当P＜0.05时，具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞凋亡结果

流式细胞术检测细胞周期表明,随GPS 浓度逐渐增高，S 期阻滞作用也逐渐增强,出现明显的“亚二倍体”凋亡峰,随浓度的增高凋亡峰也逐渐升高；TUNEL 染色法和扫描电镜观察到，GPS 使人肝癌细胞BEL-7402 发生明显的凋亡形态变化,并随浓度的增加出现凋亡作用逐渐增强；Western blot 结果显示，随GPS 浓度逐渐增高,凋亡相关蛋白Bax 的表达逐渐升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达逐渐下降,同时出现死亡受体TNFR1 的表达增强,提高ERK 磷酸化水平。

2.2 两组免疫化学法检测结果

试验组在Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白上优于对照组，有统计学意义（P＜0.05）。具体参见表格1 所示。

2.3 两组PXR 受体调控的CYP3A 诱导作用结果

PXR 受体调控的CYP3A 诱导作用结果表明，CYP3A mRNA的基础转录水平中CYP3A6、CYP3A4、CYP3A7 均无显著增加。具体参见表格2 所示。

表1 两组免疫化学法检测结果比较（%）

表2 两组PXR 受体调控的CYP3A 诱导作用结果比较

3 讨论

人肝癌细胞凋亡诱导的研究中，通过分析肿瘤发生发展中细胞增殖、生长、分化、代谢等调节失控；细胞凋亡用以清除多余、衰老和受损伤的细胞来保持机体内平衡。三叶青多糖的应用，在肝癌细胞凋亡中，充当一系列基因激活、蛋白表达调控、预防和治疗恶性肿瘤的效果确切。

汪正飞等[4]的研究表明，TFIC50 为3.247 mg/mL,TF 的高、中、低的剂量分别为5、1.25、0.312 5 mg/mL；TF 高、中、低浓度剂量48 h 后对肝癌HepG2 细胞增殖随浓度的增加而逐渐增强；TF的高、中、低剂量的抑瘤率分别为64.07%、53.64%、46.69%；抑制肿瘤生长的抑制作用优于CTX（环磷酰胺）组。李振涛等证实，三叶青具有抑制肿瘤、保肝、抗炎及调节机体免疫等多种药理活性,对抑制肝癌等多种消化系肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡,而对正常细胞无明显毒副作用,其抗瘤机制包括激活胱天蛋白酶（Caspase）家族启动凋亡、引起B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）基因家族表达变化从而促进细胞色素C 的释放等[5]。有研究认为[6]，有利于提取物中绝大多数活性成分的释放，可以对健康人群和癌症患者提供预防和辅助治疗肿瘤以及提高抗氧化活性和免疫力等功效，尤其对癌症患者的辅助治疗和康复大有益处，可消除放疗、化疗的毒副作用，增加免疫力，且同样适用于普通人预防肿瘤和提高机体抗氧化活性。高药物能抑制SMMC-7721 肝癌细胞的生长,并具有浓度依赖性，光学显微镜、荧光显微镜下观察,发现细胞凋亡现象；DNA 琼脂糖凝胶电泳可见DNA 梯形条带；流式细胞仪（Flow cytometry，FCM）检测分析出现凋亡亚二倍体峰[7]。综合来讲，介入治疗配合三叶青多糖的效果，旨在通过影响HepG2 通路，干预Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白表达，发挥其抑制细胞黏附基质、迁移和侵袭的作用[8-12]。

综上所述，三叶青多糖对人肝癌细胞凋亡诱导作用明显，且整体上加速了细胞凋亡率，改善了Bcl-2、Bax 和Survivin 蛋白表达，并无基因转录影响，值得临床实践中大力实施推广。