miR-183-5p对大肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及机制

李治岐，万里新，李晓丹，陶海云，王旸

1 新乡医学院，河南新乡 453000；2 南阳市中心医院

大肠癌(CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，约占所有癌症的10%[1]，每年新发病例约100万。目前主要依靠外科手术及放化疗等常规手段治疗，虽然早期发现的CRC患者中约90%可通过手术治愈，但由于CRC发病早期症状特异性不明，易发生漏诊，发现时往往是中后期，多由于肿瘤转移引起患者死亡[2]，导致CRC的5年生存率低于50%[3]。上皮间充质转化(EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，表现为失去上皮细胞极性，无法与基底膜连接，迁移和侵袭能力增强。重组人抑制蛋白-2(PFN2)属于一类小的G-肌动蛋白结合蛋白，是肌动蛋白聚合的调节剂[4]。研究发现，PFN2在CRC中的表达低于对照，且PFN2的低表达与肿瘤患者不良预后相关[5]。PFN2蛋白能激活三磷酸隣脂酰肌醇(PIP3)，阻断PDK/AKT/mT-OR通路，从而达到降低肿瘤细胞生长、迁移侵袭及血管生成的能力[6]，是治疗癌症的潜在标靶，具有较强的研究价值。微小RNA(miRNA)是一组长度为20～24个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因3′非翻译区(UTR)结合，抑制该基因mRNA的表达，从而对细胞增殖、分化、迁移和凋亡[7]能力进行调控。2018年10月—12月，我们拟通过数据库的预测功能，寻找PFN2的上游miRNA，探讨miRNA通过PFN2通路介导的EMT过程对CRC进展的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2018年10月—12月于河南科技大学第一附属医院行CRC手术的患者新鲜癌组织标本20例份，经病理诊断为CRC，患者无放化疗史、不合并其他器官肿瘤，临床病例资料完整。同时收集其对应的癌旁组织(距肿瘤边缘20 mm，上切缘无瘤黏膜组织)20例份。标本置于液氮中，存放于-80 ℃冰箱内。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意。人大肠癌(CRC)细胞系HCT116、HT29购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)。细胞系HCT116、HT29和正常结直肠细胞系(FHC)按照说明常规保存在实验室中。将细胞在6孔或12孔板(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，美国)中培养于5%CO2、37 ℃的培养箱中。

1.2 上游靶miRNA的预测 应用miRDB(http://mirdb.org/cgi-bin/search.cgi )预测功能，输入PFN2基因名查询即可。

1.3 组织和细胞中miR-183-5p表达检测 采用qRT-PCR法。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂(美国Invitrogen)和miRcute血清/血浆miRNA分离试剂盒(中国TIANGEN)，从组织、细胞和血浆样品中提取总RNA。使用miRNA cDNAs合成试剂盒(Applied Biologic Materials，Inc，Canada)通过逆转录反应合成cDNA。应用EvaGreen miRNAqRNA MasteMix试剂盒(加拿大Applied Biologic Materials公司)检测miR-183-5p (5′-UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU-3′)表达，内参为U6。miR-183-5p 正向引物：5′-CGCGTATGGCACTGGTAGAA-3′，反向引物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6正向引物:5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。相对表达量的计算方法采用2-ΔΔCT法。

1.4 组织和细胞中PFN2 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。对于mRNA，使用PrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara，大连，中国)从总RNA中逆转录cDNA。通过SYBR Premix Ex TagTMⅡ(Takara，大连，中国)，通过ABI 7500系统(Applied Biosystem)，使用特异性引物进行qRT-PCR，检测组织和细胞中 PFN2 mRNA的表达。β-actin作为内参。相对表达量的计算方法为2-ΔΔCT法。PFN2正向引物：5′-GCGGCCGCATGGCCGGTTGGCAGAGCTACG-3′，反向引物：5′-GGATCCTTACACATCAGACCTCCTCAG-3′；β-actin正向引物:5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′;反向引物:5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′，反向引物:5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′。PFN2 mRNA相对表达量的计算采用2-ΔΔCT法。

1.5 细胞增殖能力检测 应用CCK-8法。慢病毒miR-183-5p转染前24 h，将对数生长的 HCT116、HT29细胞转置于12孔板，分为mimics control组、miR-183-5p mimics组，调整细胞密度为1×105个/孔，当细胞融合度约为50%时进行转染，用含6 μg/mL聚凝胺的2 mL新鲜培养基替换原培养基，miR-183-5p mimics组加入慢病毒miR-183-5p悬液,mimics control组不予干预，37 ℃孵育。于12、24、48、72 h检测细胞增殖情况。操作步骤依据试剂盒说明书，之后使用酶标仪在450 nm波长下检测OD值，进行数据统计分析。

1.6 细胞迁移能力检测 慢病毒miR-183-5p转染前24 h，将对数生长期的 HCT116、HT29细胞转置于12孔板，分为mimics control组、miR-183-5p mimics组，调整细胞密度为1×105个/孔，当细胞融合度约为50%时进行转染，用含6 μg/mL聚凝胺的2 mL新鲜培养基替换原培养基，miR-183-5p mimics组加入慢病毒miR-183-5p悬液,mimics control组不予干预，37 ℃孵育。用200 μL移液器枪头在细胞培养皿中刮擦平行线，然后用 PBS洗涤并在无血清的DMEM中孵育。划痕完成后48 h显微镜下拍摄，统计细胞迁移个数。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件和GraphPad Prism软件系统。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。采用Spearman检验对miR-183-5p和PFN2表达进行相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRC癌组织和癌旁组织中miR-183-5p、PFN2 mRNA表达 CRC癌组织和癌旁组织中miR-183-5p的相对表达量分别为3.346±0.873、1.793±0.427，PFN2 mRNA的相对表达量分别为0.369±0.025、1.853±0.266，癌组织和癌旁组织中miR-183-5p、PFN2 mRNA相对表达量比较，P均<0.05。

2.2 细胞系中miR-183-5p、PFN2 mRNA表达 FHC、HCT116、HT29细胞系中miR-183-5p mRNA的相对表达量分别为0.475±0.012、1.382±0.009、0.983±0.006，与FHC相比，miR-183-5p mRNA在HCT116、HT29细胞系中表达上调(P均<0.05)。FHC、HCT116、HT29细胞系中PFN2 mRNA的相对表达量分别为1.284±0.149、0.513±0.007、0.478±0.005，与FHC相比，PFN2 mRNA在HCT116、HT29细胞系中表达下降(P均<0.05)。

2.3 miR-183-5p和PFN2表达的关系 Spearman相关性分析发现，miR-183-5p和PFN2表达呈负相关(r=-0.398，P=0.042)。

2.4 miR-183-5p对HCT116、HT29细胞系增殖及迁移能力的影响 miR-183-5p对HCT116、HT29细胞系增殖的影响见表1、2。同时点miR-183-5p mimics组细胞增殖能力高于mimics control组。mimics control组HCT116、HT29细胞迁移数分别为(29.41±0.76)、(24.74±0.84)个/HP,miR-183-5p mimics组HCT116、HT29细胞迁移数分别为(72.02±2.63)、(66.69±2.23)个/HP,miR-183-5p mimics组同种细胞迁移数均高于mimics control组(P均<0.01)。

表1 两组HCT116细胞系不同时点增殖能力比较

表2 两组HT29细胞系不同时点增殖能力比较

3 讨论

尽管治疗方案的不断发展给CRC的治疗带来了希望，但仍没有针对CRC晚期转移后的有效治疗方案。癌细胞迁移侵袭伴随着复杂的分子调控网络，一般通过入侵淋巴管或者伴随血液循环从原发部位扩散至远端组织，形成继发性肿瘤[8]。EMT是CRC转移的重要一环。EMT的启动和发展涉及复杂的信号通路和转录调节因子网络之间的串扰，如Wnts、Notch、Smads、ERK-MAPK及PI3K-AKT通路等。表现为肿瘤细胞上皮极性丧失，向间质表型细胞转化，导致肿瘤细胞浸润性增强[9]。这些变化使肿瘤细胞能够通过细胞外基质迁移至淋巴/血液血管中，实现肿瘤细胞的侵袭增殖[10]。

肌动蛋白是细胞骨架的重要组成部分，在癌症的转移中起着重要的作用[11]，PFN2在头颈癌(HNSC)中显著上调，通过激活Akt和GSK-3β的磷酸化降低β-catenin的表达，促进癌细胞的增殖，迁移和侵袭[6]。但在在口腔鳞癌及大肠癌中却发现PFN2可抑制癌细胞的增殖与侵袭[12]。我们通过qRT-PCR观察到大肠癌旁组织与癌组织相比，正常FHC细胞系与癌HCT116、HT29细胞系中PFN2均显著下调，说明PFN2蛋白表达下调与大肠癌的恶化相关。

研究表明，microRNA的失调调控了肿瘤微环境中炎性细胞因子的异常表达[13]，在CRC的进展中发挥着不可忽视的生物学功能，目前已成为调控癌症进展的重要方向[14]。研究发现 miR-183-5p参与多种癌症的进程，如在肺癌中可通过调节 PIK3CA起到抑癌的作用[15]，在胃癌中可通过调控EEF2抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[16]，但同时也有研究发现miR-183-5p在非小细胞肺癌中可通过抑制可以抑制p53，并通过磷酸化激活AKT信号通路促进肿瘤的转移和生长[17]。可见miR-183-5p在不同肿瘤中可调控不同的靶基因，生物作用差异大。本研究结果显示，miR-183-5p在CRC细胞中表达上调，表明miR-183-5p可能在CRC中起促癌作用。最后，我们将模拟物转染HCT116和HT29细胞系控制miR-183-5p的表达，通过qRT-PCR及Western blotting确定了miR-183-5p对PFN2的调控关系，最后通过CCK-8法和划痕实验发现miR-183-5p过表达可促进CRC细胞的迁移和增殖能力，促进CRC的转移。

综上所述，miR-183-5p可促进CRC细胞的增殖、迁移，其机制可能是靶向下调PFN2表达。