富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对小鼠降尿酸作用初探

2020-11-11 13:18张瑞雪张江涛李明亮谷瑞增
食品与生物技术学报 2020年9期
关键词:鸡胸肉高尿酸血症

张瑞雪,张江涛,方 磊,凌 空,朱 艳,李明亮,谷瑞增,魏 颖

(中国食品发酵工业研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技术研究中心,北京100015)

尿酸是人体嘌呤代谢的终产物,其生成过多或排出过少均可导致尿酸水平升高,从而患高尿酸血症,而高尿酸血症是急性关节炎、痛风、肾结石和尿酸性肾病重要的生化基础,而且与高血压、糖尿病、冠心病等多种传统血管疾病密切相关[1]。随着人们生活水平提高,高蛋白质和高嘌呤食物摄入量在日常生活中显著增加,高尿酸患病率也逐年提高[2]。

目前药物治疗高尿酸血症的方法有2种,其一为增加尿酸排泄,主要抑制肾小管对尿酸的再吸收,如苯溴马隆和丙磺舒,但是可能会导致尿酸盐结晶在尿管的沉积,从而引发肾功能损伤[3-4];其二是减少尿酸生成,主要是黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)抑制剂,如别嘌呤醇,不良反应有过敏性皮疹、肾毒性和肝坏死等[5]。鹅肌肽是动物体内的一种组氨酸二肽,通常从家禽骨骼肌中提取,具有显著的抗氧化、抗疲劳、降尿酸等功能,在特医食品和保健品领域已有应用[6-9]。目前鲜有文章报道鹅肌肽对高尿酸血症的作用,作者对其进行初探,以期后续深入研究鹅肌肽的降尿酸功能和机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡胸肉:中食海氏生物技术有限公司产品;小鼠(Balb/c,6~8周龄):北京维通利华实验动物技术有限公司产品,许可证号为SCXK(京)2016-0006;氧嗪酸钾、羧甲基纤维素钠(CMC-Na):北京索莱宝科技有限公司产品;别嘌呤醇:Sigma公司产品;UA、UN、CRE、XOD、ADA、AST、ALT、TG试剂盒:南京建成生物科技有限公司产品。

1.2 仪器与设备

Spectra MR多功能酶标仪:美国Dynex公司产品;恒温水浴锅:苏州珀西瓦尔实验设备有限公司产品;-80℃冰箱:Thermo Scientific公司产品;高速匀浆机:BioSpec Products公司产品;高速离心机:Sigma公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 鹅肌肽的酶解制备工艺通过本中心所优化的低聚肽制备方法制备富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物:鸡胸肉→粉碎→溶解→预热、调pH→酶1/酶2→灭酶→离心分离→脱色、脱盐→喷雾干燥→鹅肌肽粉(酶1对应样品1、酶2对应样品2)。

1.3.2 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物氨基酸组成测定 参照国标法GB/T 5009.124[10],测定样品1和样品2的氨基酸组成。

1.3.3 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物相对分子质量分布测定采用文献所述高效凝胶过滤色谱法[11],测定样品1和样品2相对分子质量及分布情况。

1.3.4 动物分组将54只小鼠称重后随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组(别嘌呤醇10 mg/kg)样品1低(38.5 mg/kg)、中(77 mg/kg)、高(154 mg/kg)剂量组,样品2低(38.5 mg/kg)、中(77 mg/kg)、高(154 mg/kg)剂量组共9组,每组6只。动物房温度为(24±1)℃,湿度(55±5)%,试验条件严格遵守《实验动物管理条例》相关规定。

1.3.5 动物给药及急性高尿酸血症模型建立对各组小鼠每天灌胃前一晚禁食,空白组和模型组每天灌胃生理盐水,阳性对照组每天灌胃别嘌呤醇,实验组每天灌胃富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物低、中、高剂量。每日称量小鼠体质量,根据体质量调整灌胃量,连续7 d。在最后一次灌胃1 h前,除空白对照组外,其余8组小鼠腹腔注射氧嗪酸钾盐500 mg/kg(混悬于质量浓度0.5 g/dL羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液)进行造模[12],以造成小鼠急性高尿酸血症,空白对照组按同样剂量腹腔注射0.5 g/dL CMC-Na溶液。腹腔注射1 h后,眼眶取血,4℃静置30 min后,5 000 r/min离心10 min,取上清液于-80℃冻存待检测。于冰台上分取肝脏、肾脏及脾脏组织,称质量记录并于-80℃冻存待检测。

1.3.6 指标检测血清中尿酸(UA)、尿素氮(UN)及肌酐(CRE)水平按试剂盒说明测定。取小鼠肝脏组织于玻璃匀浆器中,在冰水浴条件下按1 g∶9 mL的比例加入生理盐水(0.86 g/dL)反复匀浆,4℃、3 000 r/min离心10 min,取上清液,按试剂盒说明测定肝脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脱氨酶(ADA)、谷谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)水平。

1.3.7 数据处理采用Origin8.5统计软件对数据进行处理,实验结果以均值±标准偏差(Mean±SD)表示。采用组间t检验,P<0.05具有显著性差异,P<0.01具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物的氨基酸组成

氨基酸组成和质量分数如表1所示,谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、赖氨酸的质量分数较高,且富含人体必需的氨基酸和半必需氨基酸。其中质量分数最高的组氨酸是组成机体蛋白质的氨基酸之一,同时也是动物合成肌肽和鹅肌肽等功能性二肽的前体物质,在调控动物生长、提高机体抗氧化能力和肌肽含量等方面发挥重要作用[13]。

表1 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of chicken breast hydrolysate enriched with anserine

2.2 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物的相对分子质量分布

鹅肌肽相对分子质量分布情况如表2所示。鹅肌肽的相对分子质量大部分分布在1 000之下,样品1和样品2分别占总比例的94.53%和95.44%,其中在140~500之间的比例最高,样品1和样品2分别为61.41%和74.20%。在此相对分子质量范围内,一般都是二肽和三肽,此类小分子肽易消化吸收,比游离氨基酸的吸收率提高2.0~2.5倍,且具有大分子蛋白质所没有的一些物理化学特性[14-15]。

表2 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物分子质量分布Table 2 Molecular weight distribution of chicken breast hydrolysate enriched with anserine

2.3 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对高尿酸血症小鼠脏器指数的影响

尿酸合成过程中的重要酶类主要分布在肝脏中,如XOD。XOD可通过调控尿酸代谢激活炎性小体途径来加重肝细胞脂质堆积,且尿酸在体内可直接诱导小鼠肝脏胰岛素抵抗[16]。肾脏是尿酸排泄的关键脏器,高尿酸易致肾脏血液动力学、组织学和功能学改变,引起肾结石、肾纤维化、慢性肾病等严重后果[17]。由表3可看出,与空白组比,模型组小鼠的肝脏指数、肾脏指数极显著升高(P<0.01),说明小鼠急性高尿酸血症肾病模型复制成功。与模型组相比,阳性对照组的肾脏指数极显著降低(P<0.01),但是对肝脏指数并没有显著影响,样品1和样品2的中剂量均能极显著降低肝脏指数和肾脏指数(P<0.01),甚至达到空白组的正常水平。

表3 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对急性高尿酸血症小鼠肝脏指数和肾脏指数的影响Table 3 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on liver and kidney index in mice with acute hyperuricemia

2.4 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对高尿酸血症小鼠血清UA浓度的影响

约在1 500万年前,人类的尿酸酶基因发生突变,导致尿酸不能被肝脏降解为尿囊素排出体外,成为人嘌呤代谢的最终产物[1]。正常男性血尿酸为150~380μmol/L,女性更年期以前为100~300μmol/L,更年期后其值接近男性。37℃时,血清尿酸的饱和浓度约为416μmol/L,高于此值即为高尿酸血症[18]。高尿酸可以通过激活氧化应激、诱导TGF/smad信号通路的炎症反应等对肾脏造成损伤[19]。所以防治高尿酸血症,首先要降低体内尿酸水平。

模型组血尿酸浓度明显升高,与空白对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。与模型组相比,阳性对照组可极显著地(P<0.01)降低模型组动物血清中的UA水平,降低了28.49%;样品1和样品2的低、中剂量均可极显著(P<0.01)降低患有急性高尿酸小鼠的血清UA浓度,与模型组相比,分别降低了39.86%、45.71%、41.99%、34.60%。样品1的中剂量的降尿酸效果最好,并且明显(P<0.01)强于阳性对照组,此时UA浓度为165.28μmol/L,接近于空白组的UA水平136.10μmol/L,见图1。

图1 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对急性高尿酸血症小鼠血清UA浓度的影响Fig.1 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on serum UA concentration in mice with acute hyperuricemia

2.5 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对高尿酸血症小鼠血清CRE和UN浓度的影响

血清中的肌酐和尿素氮可反映肾功能的好坏。肌酐是在肌肉中从磷酸肌酸通过自发不可逆转化而形成的,通常情况所形成的肌酐量是相当恒定的,游离肌酐的循环量完全依赖于它的排泄速度[20]。尿素是人体内蛋白代谢的主要产物,构成的了血液中绝大部分的非蛋白氮。血中尿素氮来源于肝脏,通过肾脏随尿液排出体外[21]。血清肌酐和尿素氮的浓度可反映肾小球的滤过作用、肾小管的重吸收功能和尿路的通畅[22]。肾功能不足时,肌酐和尿素氮的浓度升高。

模型组的CRE和UN浓度与空白对照组相比极显著升高(P<0.01);阳性对照组的CRE浓度与模型组相比,极显著降低(P<0.01)了61.59%,但是阳性对照组的药物别嘌呤醇对UN浓度没有显著影响。样品1和样品2的低、中高剂量均可极显著(P<0.01)降低模型小鼠的血清CRE和UN浓度。样品2低、中、高剂量的能显著恢复CRE浓度至正常水平46.88μmol/L,且效果优于阳性对照组,见图2。

图2 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对急性高尿酸血症小鼠血清CRE和UN浓度的影响Fig.2 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on serum CRE and UN concentrations in mice with acute hyperuricemia

2.6 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对高尿酸血症小鼠肝脏ADA和XOD活力的影响

XOD和ADA都是嘌呤核苷酸分解代谢途径中的重要酶类,主要存在于肝脏中,其中XOD可连续氧化黄嘌呤、次黄嘌呤生成尿酸,ADA可催化腺嘌呤核苷分解为次黄嘌呤核苷,而后经核苷磷酸化酶催化生成次黄嘌呤,再经XOD的氧化作用最终生成尿酸[23]。故当机体摄入过多的核酸时,XOD和ADA活性的升高有利于加速这些核酸的分解代谢,合成尿酸,尿酸合成的简要流程示意图见图3。

鹅肌肽对小鼠肝脏ADA和XOD活力的影响与空白组相比,模型组的ADA和XOD活力极显著提高(P<0.01)。在灌胃给药别嘌呤醇后,与患有急性高尿酸血症的模型组小鼠相比,肝脏的ADA和XOD活力极显著下降(P<0.01),样品1的低、中、高剂量均能极显著降低ADA酶的活力(P<0.01),此时的ADA的酶活力分别为75.6、74.7、74.2 U/mg,已恢复至空白组小鼠肝脏的酶活力(75.6 U/mg)。样品2的低、中剂量也能极明显降低ADA酶活力(P<0.01),高剂量则不能达到此效果。富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对抑制XOD活力的效果没有阳性对照组好,与模型组相比,只有样品1的低剂量能显著降低XOD活力(P<0.05),见图4。

2.7 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对高尿酸血症小鼠肝脏AST和ALT活力的影响

AST和ALT是广泛存在于动物肝脏细胞质和线粒体中的2种重要的转氨酶,这2种酶活性高低反映小鼠体内氨基酸代谢的情况,同时可以敏感地反映肝细胞的细胞膜完整程度[24]。有文献表明高尿酸血症与AST、ALT水平升高有关,血尿酸水平升高是肝脏转氨酶水平升高的独立危险因素,当ALT与AST出现明显异常升高时可能提示机体内已经出现代谢紊乱,ALT早已用于临床来作为肝脏损伤的标志物之一[25]。

富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对小鼠肝脏AST和ALT活力的影响见图5,模型组肝脏内ALT和AST活力极显著升高(P<0.01)。与模型组相比,样品1可以极显著降低ALT活性(P<0.01),分别降低了28.443%、12.21%、24.21%,且低剂量降低酶活性的效果强于阳性对照组(P<0.01),高剂量可极显著降低AST活性(P<0.01)10.00%;样品2中剂量可极显著降低2个转氨酶的活性,尤以降低AST活性效果明显。

图5 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对急性高尿酸血症小鼠肝脏AST和ALT活力的影响Fig.5 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on liver AST and ALT activities in mice with acute hyperuricemia

2.8 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对高尿酸血症小鼠肝脏TG浓度的影响

肝脏脂肪代谢功能降低,会导致脂类物质在肝脏内堆积,进而造成肝脏的脂肪性病变,抑制XOD的表达可减少尿酸生成并显著减轻肝细胞TG含量和脂质沉积[16]。富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对小鼠肝脏TG浓度的影响见图6,与对照组相比,模型组的TG浓度极显著增高(P<0.01)。样品1低剂量能极显著降低TG浓度(P<0.01),与模型组相比降低了42.57%,且各剂量对TG浓度的影响趋势与对XOD活力的影响表现出一致性。

图6 富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对急性高尿酸血症小鼠肝脏TG浓度的影响Fig.6 Effects of chicken breast hydrolysate enriched with anserine on liver TG concentration in mice with acute hyperuricemia

3 结语

作者对富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物缓解高尿酸血症的功能进行了研究,结果表明酶解物能缓解肝脏和肾脏指数,样品1和样品2的中剂量效果最为明显,效果优于别嘌呤醇,且该剂量能有效降低血清的UA水平。样品1和样品2的鹅肌肽均能降低患有高尿酸血症的血清UN和CRE水平,富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对抑制XOD活力的效果没有别嘌呤醇好,且只有样品1的低剂量能显著降低XOD活力;样品1和样品2均能降低ADA活力,样品1可以极显著降低ALT活性,且低剂量降低酶活性的效果强于别嘌呤醇,高剂量可极显著降低AST活性。富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物对肝脏TG浓度的影响与对XOD的影响趋势具有一致性,证实了TG浓度与XOD活力具有相关性。综上所述,富含鹅肌肽的鸡胸肉酶解物具有一定的降尿酸功能,且缓解肾脏和肝脏的部分功能,可能与调节肝脏的转氨酶(AST、ALT)活力或者表达有关,后续将进一步进行研究和探讨。

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