Pycnoporus sp.SYBC-L3漆酶催化偶氮染料脱色

王 琦，徐楚涵，窦 欣，管政兵，蔡宇杰，廖祥儒*

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

关键字：Pycnoporus sp.SYBC-L3；漆酶；偶氮染料；漆酶脱色

目前世界上有10 000多种染料，被广泛地应用于纺织、造纸、皮革、化妆品等行业，每年的使用量超过70万t[1]。按照化学结构，可将染料分为偶氮染料、蒽醌染料、三芳甲烷染料，杂环染料等。偶氮染料是偶氮基两端连接芳基的一类有机化合物，占全球染料市场的比例超过50%，广泛用于多种天然和合成纤维的染色和印花[2]。染色过程中约有10%的染料未被利用而随着废水排出[3]，偶氮染料废水的排放不仅会影响水体色泽、透明度、溶氧量等，还具有高致癌性和致畸性，如果未经处理直接排出，会对生态系统和人类的健康造成严重的威胁[4]。虽然很多物理化学方法能起到较好的脱色效果，例如活性炭吸附、电凝聚、沉淀、絮凝、膜过滤、反向渗透、臭氧氧化法、离子交换处理法等，但成本高、能耗大、潜在二次污染的风险等缺陷限制了其实际应用[5]。因此，探究对印染废水中偶氮染料高效、快速、经济的降解方法有重要的意义。其中，利用生物降解法尤其是利用漆酶降解染料因其经济性及环境友好等特点而得到广泛关注[6]。

漆酶（Laccase，E.C.1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，可催化氧化酚类、芳胺、羧酸等化合物及其衍生物，在小分子介体的协助下，漆酶的底物进一步扩大[7]，其在纸浆漂白、环境激素降解、印染废水处理、木材预处理等领域展现出较好的应用潜力[8-9]。国内外学者已经开展了利用漆酶进行染料脱色的研究，漆酶来源涉及Ganoderma lucidum[10]、Ganoderma weberianum[11]、Trametes versicolor[12]、Trametes trogii[13]、Pycnoporus sanguineus[14]、Bacillus pumilus[15]、Lepista nuda[16]、Cerrena unicolor[17]等。Pycnoporus sp.SYBC-L3是作者所在实验室筛选出的优良菌株，漆酶产量高，发酵周期较短，其所产漆酶Lac-L有较好的pH稳定性和热稳定性[18]。不同来源的漆酶有不同的酶学特性与底物范围，其对染料的脱色条件及脱色效率也不尽相同[10-17，19]，因此有必要对Pycnoporus sp.SYBC-L3所产漆酶Lac-L的染料脱色应用开展针对性研究，进而探讨Lac-L在工业染料处理中的应用前景。

本文作者利用Lac-L降解酸性红1（AR1）、活性黑5（RB5）、活性紫5R（RV5R）3种偶氮染料，考察介体、温度、pH等因素对脱色反应的影响；根据脱色前后的染料溶液对小麦和水稻种子发芽的影响，评估脱色前后染料的植物毒性变化，为Lac-L在偶氮染料废水脱色方面的进一步研究及工业应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种Pycnoporus sp.SYBC-L3为作者所在实验室筛选到的漆酶高产菌株，PDA固体斜面保藏。

1.1.2 试剂活性黑5、酸性红1、活性紫5R，染料化学结构见表1，购自Sigma公司；麦芽糖、一水柠檬 酸、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O，购自国药集团化学试剂有限公司；2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、1-羟基苯并三唑（HBT）、2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）、2，6-二甲氧基苯酚（DMP）、乙酰丁香酮（AS）、香草醛（VAN）、丁香醛（SYR），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；漆酶Lac-L为Pycnoporus sp.SYBC-L3发酵液经纯化所得[18]。

1.1.3 仪器与设备紫外可见分光光度计：759S上海棱光技术有限公司产品；THZ-82A水浴恒温振荡器：苏州威尔实验用品有限公司产品；CP313电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；TGL-16M台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；SW-CJ-1FD超净工作台：苏州净化设备有限公司产品；STARTER 3100 pH分析计：奥豪斯仪器（上海）有限公司产品；AKTA avant蛋白质纯化系统：美国通用公司产品。

1.2 方法

1.2.1 漆酶酶活测定以ABTS为底物测定漆酶酶活，参照黄亮等[20]的测定方法并略做调整。反应体系为（3 mL）：2.4 mL 0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 3）、0.5 mL的1 mmol/L ABTS及0.1 mL的粗酶液。加入酶液之后在420 nm处测吸光值（ε=36 000 L/（mol·cm））。1个酶活力单位定义为：每分钟氧化1μmol的ABTS所需要的酶量。

表1 3种偶氮染料的化学性质Table 1 Chemical characteristics of three azo dyes

1.2.2 偶氮染料脱色反应及脱色率的计算脱色实验初始反应体系：反应体系总体积10 mL，染料质量浓度50 mg/L，漆酶活性1 U/L，氧化还原介体浓度50μmol/L（ABTS和DMP浓度为10μmol/L），体系pH值为4.0（20 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液），反应温度30℃。反应期间定时取样，

于各染料最大吸收波长处测定反应液的吸光度Ae。以反应体系中加入等量灭活漆酶作为对照组，于各染料最大吸收波长处测定反应液的吸光度Ac，按照以下公式计算脱色率：

1.2.3 反应体系中各参数对染料脱色的影响实验中分别改变反应体系中缓冲液的pH值（3.0～8.0）、反应温度30～70℃和添加的小分子介体种类、染料质量浓度及酶用量，测定在不同反应条件下的脱色率，考察反应体系中上述参数对染料脱色的影响。

1.2.4 染料及其降解产物对作物发芽的研究将20粒小麦或水稻种子均匀地撒在铺有干净滤纸的9 cm平板中，每24小时添加5 mL未降解染料溶液、漆酶降解后的染料溶液和蒸馏水（对照），置于30℃恒温培养箱分别培养3 d后，测定发芽率、胚芽长度和根长度。

1.2.5 数据分析每个实验重复3次，结果取平均值。采用OriginLab Origin V8.5软件对数据结果进行分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 介体对脱色的影响

为了找到最佳的介体，作者探究了7种介体对偶氮染料脱色率的影响（见图1）。不添加介体（CK）的情况下漆酶对偶氮染料的脱色率为0，表明偶氮染料不是Lac-L的直接底物，Tavares等[21]和Zeng等[22]也发现漆酶不可催化偶氮染料降解，而李松等报道了Trametes sp.LS-10C漆酶无须介体参与就可以降解偶氮染料，但无介体时脱色效率较低，添加介体后脱色效率显著提高。在添加介体的情况下，3种偶氮染料都有不同程度的降解。以DMP为介体时效果最差，利用HBT、ABTS、AS、SYR 4种介体，漆酶对偶氮染料都有较好的脱色效果，其中以HBT为介体时脱色效率最高。Khlifi[23]等发现HBT为Trametes trogii漆酶催化染料脱色的最佳介体，而来源于Aspergillus sp.的漆酶以ABTS为介体时对RB5脱色效果最好，以HBT、TEMPO、VAN为介体时脱色效率较低[21]，王天女[24]考察了酵母表达的重组血红密孔菌漆酶对RB5的脱色能力，研究中发现VAN是促进RB5脱色的最佳介体，而以AS为介体时脱色效果较差。因此，不同来源的漆酶在催化染料脱色时不同介体的催化效率存在一定的差异。

图1 介体对染料脱色的影响Fig.1 Effect of redox mediators on decolorization of dyes

2.2 温度对染料脱色的影响

反应温度是影响酶催化效率的重要因素，在一定温度范围内，染料脱色率随着温度的升高而升高，当温度升高到70℃时，3种染料的脱色率均有所下降，可能与高温导致漆酶失活有关。在40～60℃的温度范围内，3种染料均有较好的脱色率，50℃时脱色率最高（见图2）。

图2 温度对染料脱色的影响Fig.2 Effect of temperature on decoloration of dyes

以漆法降解染料的研究中，SUKALacc[25]在反应温度大于35℃后脱色效率逐渐下降，Ganoderma lucidum U-281漆酶在温度大于40℃后，脱色效率迅速降低，可能由于其热稳定性较差，因而在较高温度下酶失活的速率快而导致染料的脱色率降低；在以菌体降解染料的研究中，Karunya等[26]报道了利用Moraxella osloensis降解偶氮染料，最适温度为35℃，当温度达到50℃时，脱色效率大大降低，反应48 h后的脱色率仅有24%，石贝杰[27]利用云芝降解偶氮染料，当温度大于28℃时，脱色效率随着温度的升高而迅速下降。在印染工序中，需要45℃以上热水的工序占整个工序的90%左右，60℃和90℃以上的分别占整个工序的45%和10%左右，因此印染废水的温度较高[28]，在印染废水处理的实际应用中应该考虑到酶或菌体的耐热性。相比较而言，Pycnoporus sp.SYBC-L3漆酶Lac-L的反应温度高，热稳定性较好[18]。因此，在工业化印染废水处理中有一定的应用前景。

2.3 pH对染料脱色的影响

反应体系的pH是影响酶反应速率的另一个关键因素。AR1和RV5R在pH值为4.0时脱色率最高，而RB5的最适反应pH值为5.0。随着pH的增高，3种染料的脱色率先升高后下降，在中性和碱性条件下，AR1和RV5R仅有不到5%的脱色率，RB5在pH值为8时也仅有6.4%的脱色率（见图3）。在Zeng[29]、Ashrafi[30]和Forootanfar[31]等的研究中，漆酶在pH值在3～5时对染料的脱色率较高，之后随着pH的升高脱色率逐渐下降，本论文中pH对脱色率的影响与之相似。因此，在印染废水脱色处理过程中，为了提高脱色效率，需适当调节原水的pH到酸性范围。

图3 pH值对染料脱色的影响Fig.3 Effect of pH on decoloration of dyes

2.4 漆酶用量对脱色率的影响

反应体系中漆酶活力从0.1 U/mL上升至1 U/mL时，3种染料的脱色率随着漆酶活力的升高而升高，当漆酶活力大于1 U/mL时，脱色率无明显升高（见图4）。赵世光等[10]利用漆酶降解偶氮染料，酶用量为2 U/mL，Murugesan等[32]的酶用量为2.5 U/mL，而李松等[33]的漆酶用量达到了10 U/mL。在实际处理染料废水时要考虑到成本问题，酶用量越多其越成本越高，应该在充分考虑脱色率的基础上减少酶消耗量，提高染料降解方法的经济性。

图4 漆酶用量对染料脱色的影响Fig.4 Effects of laccase dosage on decolorization of dyes

2.5 染料质量浓度对脱色率的影响

当染料质量浓度分别在10～30 mg/L（AR1）、10～50 mg/L（RB5）、20～50 mg/L（RV5R）的 范围 内时，漆酶对3种染料的脱色率最高，后续实验染料质量浓度分别选用30 mg/L（AR1）、50 mg/L（RB5、RV5R）（见图5）。不同的染料，其质量浓度变化对脱色率的影响不同，随着染料质量浓度升高，AR1的脱色率下降最快，当染料质量浓度增加到100 mg/L时，与最高脱色率相比，3种染料的脱色率分别下降了43.4%（AR1）、14.3%（RB5）、10.5%（RV5R）。染料质量浓度对脱色反应存在一定的影响，Claus[34]、Ramirez[35]、Sayahi[13]等的报道中也存在类似的情况。

图5 染料质量浓度对染料脱色的影响Fig.5 Effects of dye concentration on decolorization of dyes

2.6 最优条件下脱色率随时间变化趋势

根据上述实验结果，在最佳脱色反应条件下，连续脱色一段时间，期间定时取样测定吸光度，观察脱色反应中脱色率随时间的变化规律，结果如图6所示。结果表明，漆酶对3种偶氮染料的脱色率随着反应时间的延长而增加，但是脱色速率逐渐减慢。AR1和RV5R几乎完全降解，其脱色率分别为96.1%（AR1）和97.8%（RV5R），而RB5的最大脱色率为83.8%。不同染料的降解速度不同，AR1在2.5 h即脱色完毕，而RB5和RV5R达到最大脱色率需要5 h。

图6 脱色率随时间变化趋势Fig.6 Change of decolorization rate of dyes with time

在染料脱色处理中，脱色时间和脱色率是整体评价脱色效率的2个重要指标。Zhou等[15]使用固定化的芽孢杆菌漆酶处理AR1，48 h后脱色率仅有69.7%。赵世光等[10]采用Ganoderma lucidum粗漆酶处理直接橙S脱色，1.5 h脱色率为63.0%，此后随着脱色时间的延长，脱色率没有明显的上升。Yadav等[36]以重组漆酶催化降解台盼蓝36 h，脱色率达到91.7%。Trametes versicolor漆酶在固定和游离状态下对酸性橙的脱色率（6 h）分别为39%和63%，在添加外源介体ABTS的情况下，脱色率均上升到73%[37]。综合对比以上研究，本研究中密孔菌漆酶Lac-L对3种偶氮染料的脱色时间相对较短、脱色率较高，因此该漆酶具有较好的应用前景。

2.7 偶氮染料脱色前后吸收图谱变化

分别对脱色前后的染料溶液、HBT和漆酶-HBT反应液进行全波长扫描，结果如图7所示。结果显示，与对照样品相比，3种偶氮染料在其最大吸收波长处的吸收峰均有明显的降低，其中AR1和RV5R的吸收峰几乎完全消失，RB5在597 nm处仍有一定的吸光值，这与之前的实验结果相同。酶降解后的AR1的光谱图上出现了新的吸收峰，与未降解染料的最大吸收峰相比，该峰的最大吸收波长变短且吸光值显著降低，曾祥康[38]在毛栓菌漆酶对AR1降解中也观察到了新的吸收峰的出现，王志新[39]采用HPLC方法观察到漆酶降解AR1后有新物质的出现。

图7 染料溶液AR1、RB5、RV5R经漆酶催化脱色前后吸收图谱变化Fig.7 Absorption spectrograms of AR1，RB5，RV5R solutions before and after decoloration catalyzed by laccase

2.8 偶氮染料降解前后对作物发芽的研究

为了使染料废水得到处理，除了需要去除其中的颜色外，还得保证脱色后的产物没有毒性才能将其排放。对偶氮染料及其酶解产物进行小麦和水稻种子的生态毒理实验（见表2—3），结果显示，利用偶氮染料灌溉小麦和水稻种子，其发芽率显著降低，小麦发芽率仅有57.6%～71.7%，水稻发芽率为73.3%～81.7%，而染料降解后对种子发芽的影响大大降低，小麦和水稻发芽率均达到90%以上，对发芽率无明显的抑制作用。使用未降解的染料灌溉小麦种子后，根和胚芽的生长受到强烈的抑制作用，对胚芽抑制率在20%～25%，对根生长抑制率在50%以上，染料降解后对根和胚芽生长的抑制显著降低，但仍存在一定的抑制作用，对胚芽生长的抑制率不到10%，对根生长的抑制率在24.5%～32.0%。与对照相比，偶氮染料对水稻种子芽生长的抑制率接近30%，对水稻根生长的抑制率均超过60%，而染料降解后对芽和根生长的胁迫有所减弱，但对其生长仍有一定的影响。

表2 偶氮染料降解前后对小麦发芽的影响Table 2 Effect of azo dyes before and after degradations on wheat germination

表3 偶氮染料降解前后对水稻发芽的影响Table 3 Effect of azo dyes before and after degradations on rice germination

偶氮染料降解前后对其他物种的毒性变化也有报道，Ghodake等[40]的研究表明，染料降解后对高粱和菜豆的发芽不存在抑制作用，对根和芽生长的抑制率也显著降低；Ashrafi等[30]报道了偶氮染料降解后对微生物 （E.coli、P.aeruginosa、S.typhi、B.subtilis、S.aureus、M.luteus）的毒性显著降低。因此利用漆酶降解偶氮染料不仅具有脱色作用，还有一定的脱毒作用。

3 结语

以Pycnoporus sp.SYBC-L3所产漆酶Lac-L对3种偶氮染料进行脱色，通过对介体、反应温度、pH、染料质量浓度、酶用量这些因素逐个考察后，得到最佳脱色条件：采用HBT为介体、50℃、pH分别为4.0（AR1，RV5R）和5.0（RB5）、染料质量浓度分别为30 mg/L（AR1）和50 mg/L（RB5、RV5R）、漆酶用量1 U/mL。在该条件下，AR1脱色2.5 h达到最大脱色率96.1%，RB5和RV5R在5 h分别达到最大脱色率83.8%和97.8%。Lac-L催化3种偶氮染料脱色的效果良好，时间相对较短，并且能够在较高的温度下进行脱色反应，具有一定的开发利用价值。

工业废水排放后有可能被用于灌溉田地。脱色前染料对种子发芽率、根和胚芽的生长有显著的抑制作用，可见未经处理的染料废水不可用于农田灌溉，而降解后的染料废水对小麦和水稻发芽率没有影响，对根和胚芽生长的影响也大大降低，说明其毒性有所降低。在偶氮染料废水处理中，除了颜色的脱去外，也需要关注有机物的降解及毒性的变化。染料脱色后产生的是何种降解产物，这些产物对不同的动物、植物、微生物是否有毒性，仍需要开展深入研究。