回顾性分析年龄与拮抗剂方案移植时机的相关性*

邓星，韩艳，彭伟，段超群，李清，刘珍

（江西省宜春市妇幼保健院生殖科，宜春336000）

在体外受精-胚胎移植／卵胞浆内单精子注射(in vitro fertilization /intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI） 治疗过程中， 采用控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）， 以获得多个卵子同时发育，从而提高周期临床妊娠率，但目前对控制性超促排卵方案的选择尚无定论。 近年来拮抗剂（GnRH antagonist,GnRH-ant）方案因无提前的垂体抑制、用药剂量少、用药天数短、且无用药初期的激发作用（flare-up）、更符合生理过程、降低卵巢过度刺激的综合征（OHSS）的风险等越来越得到临床的认可[1,2]。 但因拮抗剂方案对子宫内膜的影响一直存在争论， 使得临床对采用拮抗剂方案是否进行新鲜周期移植也没有定论。 本研究对不同年龄段采用拮抗剂方案促排卵的患者新鲜周期与全胚冷冻后第一次复苏移植妊娠结局的比较进行分析， 探讨拮抗剂方案在不同年龄阶段的新鲜移植策略。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性分析2017 年7 月-2019 年12 月于我院生殖科行体外受精或卵胞浆内单精子注射（IVF/ICSI）治疗患者的临床数据。 纳入标准：⑴夫妻双方有IVF/ICSI 治疗指征且无未控制的高血压和糖尿病、无未诊断明确的心脏病、肝肾功能异常、 恶性肿瘤等病史可能影响患者的妊娠情况；⑵患者采用促排卵方案为拮抗剂方案，新鲜周期移植或全胚冷冻后第一次行FET；⑶全胚冷冻患者系因HCG 日孕酮≥2.5ng/ml 或预防卵巢过度刺激取消移植。排除标准：⑴患有甲状腺疾病、子宫内膜异位症或免疫性疾病等；⑵取消取卵周期或无可用胚胎者；⑶宫腔镜检查提示中重度宫腔粘连者。 最终纳入274 例患者284 个周期。根据女方患者年龄分为2 组， A 组200 个周期（年龄＜40 岁），B 组84 个周期（年龄≥40 岁。 两组又分为新鲜周期移植组，包括：A1 组127 个周期、B1 组73 个周期， 全胚冷冻后第一次冻融胚胎复苏移植组， 包括A2 组62个周期、B2 组22 个周期，亚组间进行比较。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案 采用拮抗剂灵活方案。 从月经第2-3 天根据患者窦卵泡数（antral follicle count，AFC）、基础促卵泡生成素（basal follicle stimulating hormone，bFSH）水平及体重指数（body mass index，BMI）给予Gn(果纳芬,默克雪兰诺有限公司）150-300IU 开始促排卵， 注射3-4d 后行阴道B 超监测卵泡大小和血清雌二醇（estradiol，E2）、黄体生成激素（luteotropic hormone，LH）的水平，当卵泡直径≥14 mm 时[3]，或者优势卵泡直径＞12mm 且血清E2＞300pg/ml 时开始使用加用GnRHA（思则凯,默克雪兰诺有限公司）0.25 mg/d，间断阴道B 超监测卵泡生长以及抽血查E2 和LH， 调整Gn 剂量和剂型，当有2 个卵泡直径＞17mm 或者1 个卵泡直径＞18mm 时，停止注射Gn， 当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠医药，珠海）4000U 或者皮下注射艾泽(默克雪兰诺有限公司)0.25mg，给予HCG注射后34-36h 取卵。

1.2.2 取卵、 胚胎移植和黄体支持 经阴道B 超引导进行取卵、体外受精和胚胎培养，新鲜周期移植为选择1-3 个胚胎在取卵后72h 移植。 取卵当日开始肌肉注射黄体酮P（浙江仙琚制药）40mg,每日1 次+地屈孕酮片(达芙通，雅培制药) 20mg,口服，每日2 次给予黄体支持。

1.2.3 冷冻胚胎复苏移植内膜准备和黄体支持 根据患者月经周期是否规则， 内膜准备方案采用自然周期或激素替代周期。 月经规则或既往监测有排卵者， 采取自然周期，B 超监测卵泡发育排卵后3d 行胚胎解冻复苏移植并给予地屈孕酮片20mg,口服，每日2 次黄体支持；月经周期不规则、无排卵或排卵障碍者，月经第l-2 天开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，拜耳医药），3mg,每日2 次，连续口服12-14d 并做阴道超声监测，当子宫内膜≥8mm 且血E2≥200pg/ml 时肌肉注射黄体酮40mg, 每日1次+地屈孕酮片20mg,口服，每日2 次进行内膜转化为分泌期，并于转化后3d 行胚胎解冻复苏并移植，继续给予黄体酮注射液、地屈孕酮及戊酸雌二醇作为黄体支持。

1.2.4 胚胎质量评分法 取卵后48/72h 根据胚胎发育速度和形态给胚胎进评分: ⑴1 级胚胎(Ⅰ)：细胞数目正常，卵裂球致密、大小正常、对称性好、≤5%碎片。 ⑵2 级胚胎(Ⅱ)：①细胞数正常(7-9 细胞)，无碎片，任一指标欠佳（包括细胞大小、卵裂球致密性、对称性）；及各指标正常，有≤25%的碎片。⑶3 级胚胎(Ⅲ)：①无碎片，细胞大小、细胞数、卵裂球致密性、对称性中有二项指标欠佳，或任一指标异常、有大于25%的碎片；②有25%-50%的碎片；③受精第二天为二细胞； 第三天为四细胞及以下Ⅲ级起评。⑷4 级胚胎(Ⅳ)：①碎片率小于25%、细胞大小、卵裂球致密性、细胞数及对称性等多项指标异常；②大于50%碎片。 D3 优质胚胎选取标准：取卵3d 后可观察为I 级或II 级胚胎。

1.3 妊娠判断 生化妊娠的判断为移植后14d 血清β—hCG＞50mIU/ml，临床妊娠指的是移植后28d B 超检查见孕囊，而流产为妊娠不足28 周、胎儿体重不足1000g 而终止妊娠者。

1.4 统计学方法 数据统计分析应用SPSS21.0 进行。 计数资料用百分率（%）表示，组间比较用χ2检验或Fisher 精确检验； 计量资料用均数±标准差（±s）表示，比较用t 检验。P＜0.05 时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况分析 共纳入217 周期患者A 组200 个周期（年龄＜40 岁），B 组84 个周期（年龄≥40 岁。 新鲜周期移植组， 包括A1 组127 个周期、B1 组73 个周期，全胚冷冻后第一次冻融胚胎复苏移植组,包括A2 组62 个周期、B2 组22 个周期,亚组间进行比较,两亚组间患者平均年龄、体重指数、bFSH/bLH、AMH 无统计学差异（见表1，表2）。

表1 A 组患者一般情况比较（±s）

表1 A 组患者一般情况比较（±s）

A1 A2 t P周期数年龄（岁）不孕年限（年）BMI(kg/m2)bFSH/bLH hCG 日E2（pg/ml）AMH(ng/ml)127 33.0±4.5 4.1±3.8 21.9±2.8 2.1±1.0 2066.5±1259.3 2.7±3.0 62 33.0±4.6 4.4±3.0 22.2±2.5 2.0±0.9-0.080-0.578-0.866 0.782 0.936 0.564 0.387 0.435 3.7±3.4-1.867 0.064

表2 B 组患者一般情况比较（±s）

表2 B 组患者一般情况比较（±s）

B1 B2 t P周期数年龄（岁）不孕年限（年）BMI(kg/m2)bFSH/bLH hCG 日E2（pg/ml）AMH(ng/ml)73 42.5±2.0 3.1±3.0 22.8±2.6 2.6±1.3 1880.8±1320.2 1.6±1.7 22 42.8±2.6 4.5±3.6 22.9±2.4 2.4±1.0-0.686-1.756-0.075 0.823 0.495 0.082 0.940 0.412 2.3±3.1-1.047 0.305

2.2 促排卵周期资料分析 亚组间比较Gn 总量、Gn 天数（天）、获卵数、受精率、成熟卵率、D3 天优胚率、移植胚胎数、原继发不孕构成比、受精方式构成比、至少移植1 枚优胚构成比、内膜厚度均无统计学意义（见表3，表4）。

2.3 临床结局 ＜40 岁组患者新鲜胚胎移植后的生化妊娠率、 临床妊娠率及种植率均低于全胚冷冻后第一次移植组，有统计学意义（见表5）,而≥40岁患者行新鲜和全胚冷冻后第一次移植的生化妊娠率、临床妊娠率及种植率未见明显差异(见表6)。

表3 A 组促排卵情况（±s）

表3 A 组促排卵情况（±s）

A1 A2 t 或χ2 P Gn 总量（IU）Gn 天数（天）获卵数（个）成熟卵率（%）受精率（%）D3 优胚率（%）移植胚胎数（个）不孕类型(继发)（%）受精方式(IVF/ICSI)至少移植一枚优胚（%）内膜厚度(mm)2000.5±489.6 9.0±1.6 8.7±5.2 89.8±14.7 83.0±8.7 37.9±27.0 1.9±0.5 81.1(103/127)114/13 82.7(105/127)10.3±2.1 2107.2±621.6 9.3±1.9 10.0±5.8 87.8±13.0 81.4±15.1 41.2±20.3 2.0±0.4 85.5(53/62)54/8 88.7(55/62)9.8±2.1-1.285-1.233-1.517 0.921 0.575-0.932-0.534 0.555 0.300 1.167 1.562 0.201 0.219 0.131 0.358 0.566 0.353 0.594 0.456 0.584 0.280 0.120

表4 B 组促排卵情况（±s）

表4 B 组促排卵情况（±s）

B1 B2 t 或χ2 P Gn 总量（IU）Gn 天数（天）获卵数（个）成熟卵率（%）受精率（%）D3 优胚率（%）移植胚胎数（个）不孕类型(继发)（%）受精方式(IVF/ICSI)至少移植一枚优胚（%）内膜厚度(mm)2176.0±718.2 8.8±2.4 5.9±4.3 88.7±16.1 82.3±20.5 43.9±29.7 2.0±0.6 98.6(72/73)68/5 79.5(58/73)10.0±2.1 2050.0±665.0 8.7±1.6 6.9±4.4 91.6±11.7 87.9±13.8 52.4±22.9 2.0±0.7 100.0(22/22)20/2 72.7(16/22)9.3±2.4 0.733 0.147-0.930-0.762-1.197-1.237-0.118 0.124 0.444 1.276 0.465 0.883 0.355 0.448 0.234 0.219 0.906 1.000 0.724 0.505 0.205

表5 A 组临床结局

表6 B 组临床结局

3 讨论

GnRH 拮抗剂方案无需经过促排卵前的垂体降调节过程， 与GnRH 激动剂方案相比具有刺激更温和、用时更短等多方面优势[4]。 近年来，拮抗剂方案在IVF/ICSI 促排卵治疗中应用越来越多见。但是也有很多文章报道认为采用拮抗剂方案新鲜周期移植的临床妊娠率较GnRH 激动剂方案的临床妊娠率低[5,6]，而两种方案后冷冻胚胎复苏移植妊娠率无明显差异[7]。 我们现在许多中心在采用拮抗剂方案促排卵后进行全胚冷冻， 但是这使得拮抗剂方案的治疗周期大大加长， 因此探讨拮抗剂方案新鲜移植的选择策略显得尤为重要。 而无论是自然妊娠或是通过辅助生殖技术， 女性年龄都是决定能否成功妊娠的最重要因素[8-10]。

本文通过将患者＜40 岁与≥40 岁进行新鲜胚胎移植与全胚冷冻后第一次移植后的临床结局进行比较发现，＜40 岁组患者新鲜胚胎移植后的生化妊娠率、 临床妊娠率及种植率均低于全胚冷冻后移植组， 而≥40 岁患者行新鲜和全胚冷冻后第一次移植的生化妊娠率、 临床妊娠率及种植率未见明显差异。 Ming-Chao Huang 等[11]通过比较不同年龄组卵巢储备功能低下患者采用GnRH 拮抗剂和激动剂方案也发现，≤35 岁患者采用拮抗剂方案后移植胚胎种植率低，与本研究一致。 IVF 治疗中的采用不同的促排卵方案与子宫内膜容受性变化有关系[12,13]，有研究认为拮抗剂方案可能促使子宫内膜间质细胞HOXA10 表达下降[14]，从而导致子宫内膜容受性改变。 Siraypiwat 等[15]研究结果显示，有正常排卵的妇女，在卵泡期注射GnRHA 后种植窗口期子宫内膜容受性的标志物同源框基因10（HOXA10）蛋白表达没有明显影响。 但是，我们的数据显示在不同年龄组患者采用拮抗剂新鲜移植和全胚冷冻后复苏移植后的临床结局不一样，Ming-Chao Huang 等也研究认为子宫内膜容受性受年龄的影响应该较小。 我们也知道成功妊娠还需要胚胎与子宫内膜的同步性。 拮抗剂方案可能导致子宫内膜提前成熟，干扰了胚胎种植窗[16]。 胚胎与子宫的同步性是受COS 方案调节的， 一些研究表明， 超生理水平的雌激素不利于新鲜周期的妊娠[17,18]。 但目前关于年龄在新鲜周期移植与冷冻胚胎移植后临床结局相关性的研究相对少见。Ange Wang 等[19]对新鲜移植与冷冻胚胎移植的种植率和持续妊娠率比较认为>35 岁患者冷冻胚胎移植似乎更有利，与本文数据不一致，但是文中指出HCG 日孕酮>1.0ng/ml 时，>35 岁组冷冻胚胎移植更为有利，这个差别有可能是因为HCG 日孕酮升高影响了新鲜周期的临床结局。 目前我们的结果显示不同的年龄新鲜移植存在临床妊娠率的差异性，但机制不明，我们推测可能与≥40 岁新鲜周期卵泡数少、HCG 日E2 较年轻患者更低， 对子宫内膜容受性的影响更小有关， 但我们现数据尚不能支持HCG 日E2 水平是影响子宫内膜容受性的唯一因素，这需要进行进一步的机制研究。

综上所述，＜40 岁患者采用拮抗剂方案建议考虑行全胚冷冻后复苏移植， 而≥40 岁患者可以考虑新鲜胚胎移植。 我科方案选择倾向于年轻、卵巢储备功能好的患者选择GnRH 激动剂方案，高龄、卵巢储备功能低下和部分高反应的患者选择拮抗剂方案。 因此，本研究中纳入研究对象存在偏倚，需要扩大样本量、设计更为合理的进一步研究。