miRNA-192在肝细胞癌组织中的表达及意义

孙玉珍 李世朋 赵建龙

(1阜外华中心血管病医院，河南 郑州 450000；2焦作市人民医院普外科；3河南科技大学医学院)

miRNA家族是长度约22个碱基的小分子非编码单链RNA，具有广泛性和多样性的特点，能够阻遏mRNA的翻译，进而影响蛋白质的表达。人们发现miRNA具有重要的监管职能并能调控多种生物进程，其表达的改变能够导致癌症的发生及进展〔1〕。其中miRNA-192在肿瘤的发生发展及转移过程中所起的作用受到人们的广泛关注，但miRNA-192在肝细胞癌中的表达情况及临床意义还需进一步研究。本研究探讨miRNA-192在肝细胞癌中的表达及意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集河南科技大学第一附属医院2009年6月至2013年 8月接受肝细胞癌手术治疗的肝细胞癌组织43例及癌旁组织33例，组织学分级按Edmondson-Steiner分级法分为Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ～Ⅱ级归为高中分化组，共31例，Ⅲ～Ⅳ级归为低未分化组，共12例。TNM分期按照UICC/AICC 2010年标准，Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期18例。有淋巴转移6例，无淋巴转移37例。所有患者术前未行放化疗，临床资料完整。另取正常肝脏组织25例作为对照。病理诊断由两位病理科医生采用双盲法认定。

1.2主要试剂与仪器 mirVanaTM miRNA提取和分离试剂盒(Ambion，美国)，Taq DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶和T4 DNA 连接酶(Fermentas，深圳)，M-MLV反转录酶(Promega 美国)，RiboLock RNA 酶抑制剂(Fermentas，深圳)；DYY-7型转移电泳仪(北京市六一仪器厂)，PTC-200型PCR热循环仪(Bio-Rad，美国)，iQ5荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad，美国)，LabWorksTM凝胶成像及分析系统(UVP，美国)，F-4500型突光检测仪(HITACHI，日本)，UV-2000型可见/紫外分光光度计(UNICO，美国)。地高辛标记的miRNA-192探针(稀释至100 nmol/L)，原位杂交试剂盒(博士德，武汉)，二氨基联苯胺(DAB)显色液试剂盒(中杉金桥，北京)，其余试剂为分析纯。

1.3原位杂交 原位杂交检测 microRNA-192，将组织切片脱蜡和水化，蛋白酶 K(1 μg/ml)室温孵育30 min。滴加0.1 mol/L甘氨酸-磷酸盐缓冲液(PBS)终止消化，滴加预杂交液，预杂交30 min。0.2×SSC缓冲液冲洗后滴加杂交液，90℃孵育10 min，将切片置于盛有0.2×SSC缓冲液的湿盒中37℃孵育过夜 。冲洗后滴加封闭液，37℃孵育30 min。滴加兔抗地高辛IgG，湿盒37℃孵育30 min。PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG，湿盒37°孵育30 min。滴加DAB显色。杂交过程以U6探针(1 nmol/L)作为阳性对照，去除探针作为阴性对照。microRNA-192以肿瘤细胞质中出现明显的棕黄色颗粒为阳性染色。采用半定量积分法判断结果。染色强度分级：1分，无染色，为阴性；2分，低等强度染色，为弱阳性；3分，中等强度染色，为中等阳性，>3分，强染色，为强阳性。阳性细胞数分级：1分为阳性表达率<10%；2分为阳性表达率 10%～50%；3分为阳性表达率>50%。以上两项分数相乘，得分1～3分者为低表达，>3分为高表达。

1.4实时定量RT-PCR 将组织脱蜡及水化，蛋白酶K消化后，按mirVanaTM miRNA提取和分离试剂盒说明书提取总miRNA 。根据miRNA-192的基因信息及内参U6的基因信息，运用Primer Premier 5.0软件分别设计RT及PCR引物，miRNA-192 RT引物序列：5′-GAGGCACAGCUUGACCUAUG AAUUGCAGCCAGGCUCCGUGUUGAACUGGAUACUU AACGUCGGUC GGCTGT-3′；PCR引物序列：正义链5′-CTGACCTATGAATTG-3′，反义链5′-GACCTATGAATT-3′。U6 RT引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；PCR引物序列正义链5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反义链5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。按照 Taqman microRNA assay 荧光实时定量 PCR 试剂盒的方法，首先对各组织的miRNA进行逆转录，然后在实时定量PCR仪上进行荧光实时定量 PCR，条件：50℃，10 s；95℃，9 min；95℃，12 s；循环35次，60℃，1 min，50 μl反应体系。iQ5荧光定量PCR检测系统读出各组织的 Ct 值，miRNA-192相对表达量的 microRNA分析用 U6 作内参，结果用 ABI自带软件分析。

1.5统计学方法 应用SPSS19.0 统计软件进行t、χ2检验。

2 结 果

2.1原位杂交的结果分析 miRNA-192探针结果显示呈棕黄色颗粒的阳性信号，定位于胞质，见图1。miRNA-192在正常肝组织、癌旁和肝细胞癌组织中的表达率差异有统计学意义(χ2=23.698，P<0.000 1)，见表1。

图1 miRNA-192在不同组织中的表达(DAB，×200)

表1 miRNA-192在不同组织中的表达(n)

2.2RT-PCR的结果分析 在肝细胞癌组织中 miRNA-192的含量(1.83±0.43)显著低于正常肝脏组织(4.05±0.32，P<0.01)及癌旁组织(2.89±0.19，P<0.05),且癌旁组织miRNA-192的含量明显低于肝细胞癌组织(P<0.05)。

2.3miRNA-192的表达与肝细胞癌临床病理参数的关系 miRNA-192在低未分化肝细胞癌中的阳性率明显低于高中分化者(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期肝癌组织中miRNA-192的表达水平低于比Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)；有淋巴结转移肝癌中的阳性率明显低于无淋巴结转移者(P<0.05)，见表2。

表2 肝细胞癌中miRNA-192表达与临床病理学参数的关系

3 讨 论

肝细胞癌占全世界原发性肝癌的70%～85%〔2〕，在我国约占90%〔3〕。研究证明，肝细胞癌发生过程中有的microRNA含量上升，有的microRNA含量下降，异常表达的microRNA影响其发生侵袭性和预后〔4，5〕，它们能通过特异性结合于蛋白mRNA的3端非编码区(3′-UTR)，从而影响该蛋白的表达。miRNA-192(MI0000234)定位在11号染色体(64658609-64658718)，在肝脏、结肠和肾脏组织中表达丰富〔6〕。miRNA-192目前已被证实在多种肿瘤中均存在表达异常的现象，提示其参与了肿瘤发生发展及侵袭转移的生物功能。吴蔚芸等〔7〕采用实时定量RT-PCR技术发现结直肠癌组织中miRNA-192的表达下调，显著低于非肿瘤组织，并发现miRNA-192的低表达与淋巴结转移及远处转移有关；Feng等〔8〕的研究表明与正常肺组织相比，miRNA-192在肺癌组织中表达下调，在体外实验中，过表达miRNA-192通过作用于RB1基因可以抑制肺癌细胞的增殖和促进凋亡。李娟〔9〕发现在胃癌miRNA-192低表达组中，miRNA-192的低表达与肿瘤的大小、大体分型和pT分级相关。肿瘤越大，分型分级越重，miRNA-192表达量越低。谢琼慧等〔10〕初步证实HepG2细胞中miRNA-192的下调能够降低p53和CD-KNIA的表达水平，抑制p53介导的细胞周期阻滞，促进癌症的发生。下调RB1表达很可能是miRNA-192促进HepG2细胞凋亡的机制之一〔11〕。於雷〔12〕利用microRNA芯片发现miRNA-192在肝癌组织中表达下调，体现出抑癌作用，肿瘤组织中miRNA-192与患者术后无瘤生存率显著相关。本结果说明miRNA-192表达水平的下降与肝细胞癌的组织类型、TNM分期、淋巴转移情况存在相关性。这些特征都与肿瘤的发展及不良生物学行为密切相关，其中淋巴结转移更是患者预后不良的重要标志，因此我们推测miR-192表达下调在肝细胞癌发生发展、侵袭转移过程中起重要作用，并影响肝细胞癌患者的远期生存预后。microRNA-192 有望作为一种预测肝细胞癌病情进展及预后的潜在生物学标志物。