PTEN诱导激酶1抵抗胃癌细胞凋亡并诱导奥沙利铂耐药

吴珍珍 刘志宏 杨楠彦 吴晶晶 梁俊广 孙丽

南方医科大学南方医院肿瘤内科（广州510515）

PTEN诱导激酶1（PTEN-induced kinas 1，PINK1）是一种线粒体相关蛋白。研究报道，PINK1 可参与多种线粒体相关信号通路的调控，在帕金森病等神经系统疾病中具有重要作用［1-3］。研究显示，在氧化应激条件下，PINK1 可通过上调抗凋亡相关基因，如Bcl-xL 等，并参与PI3K/Akt/mTOR 信号通路，起到保护神经元的作用［4-6］。近年来研究［7-11］发现，PINK1 在多种肿瘤组织中均显著高表达，且参与肿瘤的发生发展及耐药。氧化应激所激活的信号转导通路亦是肿瘤进展的关键环节之一［12］。进一步对PINK1 是否通过氧化应激参与肿瘤进展进行了探索，发现PINK1 可对肿瘤细胞线粒体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）平衡产生影响，通过改变ROS 产量激活下游代谢相关通路［13］。目前关于PINK1 在肿瘤中的作用研究尚处于起步阶段，其在胃癌中的具体作用机制尚未见相关文献报道。PINK1 在氧化应激过度刺激的胃癌细胞中如何起作用，PINK1 是否可通过调控氧化应激参与胃癌的发生及发展，上述问题亦未见相关研究。本研究拟在细胞水平初步探讨PINK1 在胃癌细胞中的作用，以及其对于化疗敏感性的影响，为开发胃癌新的治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞人永生化胃上皮细胞株GES-1、人胃癌细胞株BGC803、BGC823、MKN45、MGC803、SGC7901 来自于南方医院肿瘤科实验室。

1.1.2 组织标本76 例接受奥沙利铂为基础的术后辅助治疗的胃癌石蜡病理标本来自于南方医院，应用世界卫生组织胃癌病理标准进行组织学分类及分级，术后临床及病理分期均采用国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会（UICC/AJCC）制定的第七版胃癌分期标准。入组标准：（1）接受胃癌标准D2 根治术；（2）术后病理明确为胃腺癌；（3）术前均未接受新辅助放化疗；（4）术后接受含奥沙利铂的mFOLFOX6 方案或CapeOX 方案辅助化疗，但未接受放疗。所需的患者数据信息均通过查阅患者手术前以及手术后的病历资料获得，且所有病例随访资料齐全。本研究均已通过南方医科大学伦理委员会的申请。

1.1.3 主要试剂PINK1 小干扰RNA（干扰片段序列详见表1）、基因引物购于上海生工生物工程股份有限公司；PINK1、GAPDH 抗体购于Abcam公司。

表1 PINK1 干扰片段序列列表Tab.1 Interference fragment sequence of PINK1

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR检测细胞株中PINK1及凋亡相关基因表达RNA 提取和qRT-PCR：按照Trizol 说明书使用试剂盒提取细胞的总RNA，再使用紫外分光光度仪检测RNA 浓度及纯度，并使用反转录试剂盒将所提RNA 逆转录成cDNA，利用定量即时聚合酶链锁反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的方法检测细胞中PINK1的表达量，GAPDH 作为内参来标定并测算出相对定量值（RQ 值）（表2）。

1.2.2 小干扰RNA瞬时转染胃癌MKN45细胞于六孔板中每孔接种5 × 105个MKN45 细胞，严格按照Lipofectamine 2000 说明书进行转染，48 h 后通过qRT-PCR、Western blot 实验来验证转染效果。

表2 引物序列列表Tab.2 Primer sequence list

1.2.3 Western blot 检测转染后MKN45 细胞中PINK1 的表达瞬时转染RNA 干扰片段24 h 后，在冰上使用蛋白裂解液分离提取MKN45 细胞中的总蛋白，高温变性后将蛋白样本加入聚丙烯酰胺分离凝胶中，将蛋白电泳分离开后进行转膜，随后采用5%脱脂牛奶封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜，洗涤后用荧光二抗室温孵育1 h，TBST 清洗3 次后使用红外激光成像分析系统（双色odyssey）显示得到PINK1 和GAPDH 的蛋白显影条带。

1.2.4 MTT 法实验检测胃癌细胞增殖能力的改变将细胞接种在96 孔板中（1 × 105/孔），并设置平行孔，相应处理后予5 mg/mL 四甲基偶氮唑盐（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT），即0.5%MTT 溶液孵育4 h，随后取出加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL 进行室温溶解，震荡10 min，多功能酶标仪490 nm 波长检测吸光度值。

1.2.5 细胞划痕实验检测PINK1 对于胃癌细胞迁移能力的影响将转染小干扰RNA 的MKN45 细胞种于24 孔板中（5 × 105/孔），24 h 后待细胞贴壁长满用100 μL 枪头比着直尺垂直于24 孔板进行划痕，PBS 洗涤3 次后拍照，孵箱培养24 h 后再次拍照。

1.2.6 Transwell 侵袭实验检测PINK1 对于胃癌细胞侵袭能力的影响将200 μL 转染siRNA 的MKN45 细胞混悬液置于Transwell 小室上室中，同时下室加入700 μL 含10%胎牛血清1640 培基，孵育24 h 后甲醇固定10 min、结晶紫染色30 min，置于显微镜下观察细胞形态并拍照、计数。

1.2.7 免疫组化将石蜡病理标本切成4 μm 厚度切片，脱蜡至水、抗原修复后，PINK1 一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后二抗孵育1 h，二抗室温孵育1 h，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色1 min，苏木素复染3 min，梯度脱水、透明，封片，镜下观察。染色评分分别由3 位病理专家结合临床病理参数进行。结果根据其表达强弱分为0 ～6 分，0 分为阴性表达，1 ～5分为阳性表达，6分为强阳性表达。

1.2.8 统计学方法采用GraphPad Prism 7.0 软件对数据进行统计分析。计量资料两组间比较采用两独立样本t检验；两组以上组间比较采用方差分析。计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建并验证PINK1 沉默的胃癌细胞株采用qRT-PCR 技术检测不同胃癌细胞（BGC803、BGC823、MKN45、MGC803 和SGC7901）及永生化的上皮细胞（GES-1）中PINK1 的表达情况，发现PINK1 在胃癌细胞中显著高表达，其中在MKN45的表达最高（图1A）。然后构建3 条siRNA 沉默序列，分别针对PINK1 序列的555（siPINK1-1）、1030（siPINK1-2）、1728（siPINK1-3）位点，瞬转至MKN45后PCR 验证其沉默效率，发现siPINK1-1 沉默效果最佳（图1B），因此随后的实验均采用此沉默序列。同时，进一步的蛋白实验也证实，siPINK1-1干扰片段可以显著抑制MKN45 细胞PINK1 的表达（图1C、1D）。

图1 构建并验证PINK1 沉默的胃癌细胞株Fig.1 Construction and verification of PINK1 knock-down gastric cancer cell lines

2.2 PINK1 下调可抑制胃癌细胞增殖、侵袭及转移MTT检测PINK1下调对胃癌细胞增殖能力的影响，结果显示沉默PINK1表达之后，胃癌细胞的增殖能力有下调趋势，存活细胞显著减少（图2A）。该结果从增殖层面证实PINK1 可能对于胃癌细胞存活有重要意义。Transwell、划痕实验结果显示，相较于对照组，沉默PINK1后可显著下调胃癌细胞的迁移能力（图2B、图2C，P＜0.001）及侵袭能力（图2D、图2E），结果差异有统计学意义。以上结果显示，PINK1 可促进胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力，下调PINK1的表达可部分逆转胃癌细胞的恶性生物学行为。

2.3 PINK1 促进胃癌细胞凋亡既往研究［14-18］证实，胃癌中存在高水平的氧化应激，而氧化应激与胃癌的发生发展联系密切；同时PINK1 作为线粒体相关蛋白，在多个层面参与了氧化应激［4-6，13］。PINK1 可能影响了胃癌细胞的氧化应激水平，从而发挥其促癌作用。利用ROS（活性氧）试剂盒，检测了MKN45 细胞ROS 的变化，发现沉默PINK1可促进ROS 的产生（图3A、图3B，P＜0.001）。

检测凋亡相关基因的表达结果显示，相较于对照组，下调PINK1可显著抑制MKN45细胞中Bcl-2的表达（图3C），而Caspases-3表达无显著差异（图3D）。这可能与Caspases-3 作为细胞凋亡的关键蛋白，主要以磷酸化的形式产生作用有关，需进一步探讨其蛋白水平的改变。以上结果提示在氧化应激的环境下，PINK1可抵消部分升高的ROS，从而使细胞内的ROS 在一个较为适合肿瘤细胞生存的水平，诱导肿瘤抗凋亡基因表达的上调，促进肿瘤细胞的存活。

图2 PINK1 诱导胃癌细胞增殖及迁移Fig.2 PINK1 induces proliferation and migration of gastric cancer cells

图3 PINK1 促进胃癌细胞凋亡Fig.3 PINK1 promotes apoptosis of gastric cancer cells

2.4 下调PINK1 可诱导胃癌细胞化疗增敏考虑到药物耐药与氧化应激适应密切相关［19-20］。随后检测了PINK1 是否可影响胃癌细胞的药物敏感性。不同浓度的奥沙利铂处理MKN45 细胞24 h，发现下调PINK1 表达可显著改善胃癌细胞对于奥沙利铂的敏感性，细胞增殖受到显著抑制（图4A）。同时检测了野生型胃癌细胞MKN45 在不同浓度的奥沙利铂的刺激下PINK1 的表达情况，在40 μmol/L 的刺激下PINK1的表达明显增加（图4B）。临床数据显示，76 例接受奥沙利铂为基础的术后辅助治疗的胃癌患者石蜡病理标本进行PINK1 蛋白免疫组化检测，其中2 例由于脱片严重，无法评估免疫组化结果，在后续分析中剔除。临床数据分析发现PINK1 高表达的患者，含奥沙利铂术后辅助治疗的患者复发风险增加（图4C）。

图4 PINK1 影响胃癌奥沙利铂药物敏感性Fig.4 PINK1 influences oxaliplatin sensibility of gastric cancer cells

3 讨论

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，患者在现有治疗手段干预下尚无法获得满意的总体生存率，因此寻找新的治疗策略迫在眉睫［21-22］。氧化应激是机体活性氧成分与抗氧化系统之间平衡失调引起的一系列适应性的反应，而氧化应激所激活的促癌信号转导通路则是肿瘤进展的关键环节之一，与胃癌的发生发展密切相关［14-18］。寻找并阻断氧化应激刺激下肿瘤细胞中的促癌信号转导通路，可能成为治疗胃癌的新靶点［17］。

PINK1 是一种线粒体相关蛋白，可调控线粒体稳态，具有促进细胞生存、抵抗凋亡以及细胞保护等细胞生物学功能，对线粒体内ROS 的平衡具有重要作用［4-6，13］。PINK1被报道参与调控多个肿瘤生物学过程，通过影响线粒体自噬、肿瘤免疫、肿瘤干性等方面诱导肿瘤的恶性生物学行为［7-11］。然而PINK1 在胃癌中的作用目前鲜有报道。本研究首次发现PINK1 在胃癌细胞中高表达，参与调控胃癌细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为并促进胃癌细胞存活，初步阐明了PINK1 的致癌作用；进一步的机制探讨，发现PINK1 可抑制胃癌细胞ROS 的产生，促进抗凋亡基因的表达，诱导胃癌细胞的存活。

奥沙利铂是胃癌治疗的最有效药物之一，通过与DNA 的相互作用，阻断DNA 复制，引起细胞周期阻滞和细胞死亡［23］。另一方面，奥沙利铂还可以通过氧化应激反应生成过氧化氢等活性氧自由基（ROS）产生细胞毒性，导致DNA 氧化损伤［24］。氧化应激水平的改变、ROS 产生抵消均可能是导致奥沙利铂耐受的重要原因。本研究结果显示，奥沙利铂可上调胃癌细胞PINK1 的表达，下调PINK1 的表达可显著改善肿瘤细胞对于奥沙利铂的敏感性；同时PINK1 还可以下调胃癌细胞ROS的产生。初步推测PINK1 可能是导致奥沙利铂治疗失败的原因，而进一步的临床数据也提示在接受奥沙利铂辅助治疗的胃癌患者中PINK1 高表达者复发风险增加。

综上所述，本研究初步在胃癌细胞水平探索了PINK1 的促肿瘤作用，发现PINK1 通过诱导抗凋亡相关基因的转录，保护氧化应激下胃癌细胞存活，并诱导奥沙利铂耐药。然而，本研究仅在细胞水平和临床数据上对PINK1 在胃癌中的作用进行了初步探讨，在进一步阐明具体机制关键环节仍需要进一步补充。PINK1 在胃癌中除了氧化应激途径是否参与其他信号通路而对胃癌的发生发展产生影响也有待更为深入的研究。目前已有研究报道将PINK1 与肿瘤免疫调节相联系［25］。随着肿瘤免疫治疗的兴起，PINK1 在肿瘤微环境与肿瘤相关免疫中的作用可能成为下一步研究关注的方向。