全氟辛酸PFOA对斑马鱼生物毒性效应的影响研究

潘伟一,韩菊,沈洪艳

(1.河北科技大学 环境科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省药用分子化学重点实验室，河北 石家庄 050018)

全氟辛酸(C8F17COOH，简称PFOA)是一种新型持久性有机污染物[1]。因其具有较强的化学稳定性、抗氧化性及疏水、疏脂等特性[2-3]，被广泛应用于生产生活用品中[4-6]，易蓄积在环境水体中，在长江和黄河等水体中均有检出[7-8]，因其具有难降解性、持久性、蓄积性及生物毒性[9-10]，已经在生态系统中广泛传播，并通过食物链蓄积在食肉动物和人体内[11]。因此，PFOA毒性效应已经成为当前研究的热点问题，本研究以斑马鱼为受试生物，研究水体中PFOA对斑马鱼自由基(ROS)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AchE)和乳酸脱氢酶(LDH)的影响，为PFOA对水生生物毒性提供毒理学数据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

斑马鱼，购自某生物研究所；ROS，购自德国耶拿分析仪器股份公司；SOD、MDA检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；PFOA(纯度为96%)、二甲基亚砜试剂(无水溶剂级)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇为优级纯；乙醇、冰醋酸均为分析纯。

JJ323BC精密电子天平；2-16PK台式高速冷冻离心机；Spectramax190酶标仪；photochem抗氧化剂自由基分析仪；Pipet-Lite和TopPette Pipettor移液枪；HH-4恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 实验生物培养 斑马鱼在充分曝气的自来水中驯养15 d，以充分适应实验室环境，驯养期间斑马鱼自然死亡率低于2%，并在实验前24 h停止喂养。

1.2.2 毒性实验 本研究为亚急性毒性实验，为保证受试生物在实验过程中不死亡，设置实验最高暴露组浓度为96 h半数致死浓度的1/5，根据急性毒性实验结果，PFOA 96 h LC50为661.695 mg/L，所以设置本实验暴露组浓度分别为0,5,15,45,135 mg/L。每个暴露组设3组平行，重复3次实验。实验采用静态实验方法，实验期间，在玻璃鱼缸中分别加入4 L对应浓度的PFOA实验液体，将驯养后的斑马鱼投放至各暴露组，每组25条，于暴露后的第3,6,9,12,15 d测定斑马鱼肌肉组织中组织蛋白含量、ROS含量、SOD活力、MDA含量、LDH活性，斑马鱼头部AchE活性。

1.2.3 数据处理 本实验数据采用Microsoft Excel 2010进行处理，实验作图使用Origin 8.6，使用GraphPad Prism 5、SPSS17.0对数据进行单因素方差分析和Tukey多重比较检验，p<0.05表示轻微显著性差异，标记为*，p<0.01表示显著性差异，标记为**，p<0.001表示极显著性差异，标记为***。

2 结果与讨论

2.1 PFOA对斑马鱼肌肉组织ROS含量的影响

图1 各暴露组PFOA对斑马鱼肌肉组织ROS含量的影响Fig.1 Effects of PFOA in each exposed group on ROS content in zebrafish muscle tissue

由图1可知，在整个实验周期内溶剂对照组与空白组斑马鱼肌肉组织ROS含量无显著差异，且趋于一致，由此判定助溶剂对斑马鱼肌肉组织毒性可忽略不计，不影响PFOS对ROS含量的毒性效应。暴露第3 d，各暴露组ROS含量均高于空白组，表明斑马鱼对PFOA有应激反应，除15 mg/L暴露组以外，其余5,45,135 mg/L暴露组ROS含量均显著高于空白组(P<0.05)，且暴露浓度越高，产生的ROS值越高，其中135 mg/L暴露组ROS含量最高，为0.060 μmol/mL，这表明PFOA打破了斑马鱼细胞的动态平衡，迫使其产生ROS应对污染环境。暴露至第6 d时，各暴露组与空白组相比显著性差异更明显(P<0.01)，其中在5 mg/L暴露组中ROS含量比空白组高出0.013 μmol/mL，表明斑马鱼肌体持续受到PFOA胁迫后，斑马鱼机体内多余的ROS未被清除。暴露第12 d，斑马鱼肌肉组织中ROS显著减少(P<0.01)，表明鱼体内应胁迫产生的ROS已被SOD清除，但135 mg/L暴露组ROS含量仍高于空白组，直至暴露后第15 d 135 mg/L暴露组ROS含量与空白组才无显著差异，表明在第15 d 135 mg/L暴露组斑马鱼体内应PFOA胁迫产生的ROS才被SOD清除，但ROS消除时间较5,15,45 mg/L暴露组延迟了3 d，表明高浓度的PFOA对斑马鱼ROS诱导作用更显著，呈现明显剂量-效应关系和时间-效应关系。Jia等[14]通过研究异烟肼对斑马鱼幼鱼的毒性效应得出:异烟肼对斑马鱼ROS具有诱导作用，并引起斑马鱼肌体抗氧化能力下降，本研究斑马鱼肌肉组织内ROS含量在暴露9 d内显著高于空白组，说明PFOA对斑马鱼ROS同样具有诱导作用。

2.2 PFOA对斑马鱼肌肉组织SOD活力的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是一种抗氧化酶，可以消除机体内ROS，保护机体免受损伤，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，是一类敏感的分子生态毒理学指标[15-16]。各暴露组PFOA对斑马鱼肌肉组织SOD活力的影响见图2。

图2 各暴露组PFOA对斑马鱼肌肉组织SOD活力的影响Fig.2 Effects of PFOA in each exposed group on SOD activity in zebrafish muscle tissue

由图2可知，在暴露第3 d，与空白组相比暴露于5 mg/L PFOA的斑马鱼SOD活力出现轻微显著差异(P<0.05)，135 mg/L暴露组出现了显著差异(P<0.01)，但PFOA对斑马鱼SOD活力均表现为抑制作用。暴露第6 d，15 mg/L暴露组出现了极显著差异(P<0.001)，各暴露组斑马鱼机体内SOD活力均低于空白组，且随着暴露组浓度的升高，SOD活力显著降低(P<0.01)，表明鱼体受到PFOA胁迫后，产生ROS(见图1)，SOD为消除ROS大量减少，表现为抑制作用，与ROS含量变化相比较，鱼体内SOD活力与ROS含量变化呈现“相反”趋势。暴露9 d后，5,15,45 mg/L暴露组SOD活力均高于空白组，且达到本次实验最高值，分别为54.782，44.692，51.387 U/mgprot，表明肌体为了消除PFOA对肌体造成的氧化损伤产生大量SOD用于消除ROS。此时，PFOA对SOD表现为诱导作用，但135 mg/L暴露组SOD活力低于空白组，PFOA对SOD表现为抑制作用。暴露第12～15 d，5,15,45 mg/L暴露组SOD活力与空白组无显著差异，这表明鱼体抗氧化系统与外界胁迫达到了平衡，由图2可知，此时ROS含量也显著降低，并恢复至空白组水平，表明鱼体已经消除了PFOA对肌体的不利影响。但135 mg/L暴露组SOD仍显著低于空白组(P<0.01)，此时ROS含量已经恢复至空白组水平，表明为消除ROS消耗了大量SOD，也可能是随着暴露时间的延长，PFOA浓度的升高，SOD的合成受到一定影响，所以135 mg/L的PFOA对斑马鱼SOD活性有抑制作用。高问等[17]通过土霉素废水对斑马鱼的生物毒性效应研究也发现，随着暴露时间的延长低浓度的土霉素废水可引起斑马鱼氧化应激反应，导致SOD被诱导，而高浓度土霉素废水可以抑制SOD的合成，与本文研究结果一致。

2.3 PFOA对斑马鱼肌肉组织MDA活力的影响

丙二醛(MDA)是一种脂质过氧化物，可以反映细胞损伤的程度，其含量越高，机体脂质过氧化损伤越严重[18-19]。MDA含量与ROS含量在一定程度上具有一定的正相关性，与SOD活力在一定程度上有一定的负相关性。各暴露组PFOA对斑马鱼肌肉组织MDA含量的影响见图3。

图3 各暴露组PFOA对斑马鱼肌肉组织MDA活力的影响Fig.3 Effects of PFOA in each exposed group on MDA content in zebrafish muscle tissue

由图3可知，斑马鱼暴露于PFOA后第3～9 d，各暴露组MDA含量均显著高于空白组，其中15,135 mg/L差异极显著(P<0.001)，表明PFOA诱导鱼体产生了ROS，未被SOD消除的ROS攻击了生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，产生大量MDA。其中45 mg/L暴露组MDA含量在第6 d达到本次实验峰值5.08 nmol/mgprot。当暴露时间延长至第12 d，除15 mg/L暴露组外，其余各暴露组MDA含量均显著低于空白组(P<0.01)，同时，各暴露组斑马鱼体内ROS含量显著低于空白组，SOD活力与空白组均无显著差异，表明鱼体内ROS已经被消除，因此斑马鱼体内不产生MDA。暴露第15 d，各暴露组MDA含量与空白组均无显著差异，各暴露组MDA的含量恢复到正常水平，与ROS含量变化相一致，表明机体已经适应了PFOA造成的氧化损伤。王奇等[20]通过研究磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基异恶唑三种典型磺胺类抗生素对罗非鱼肝脏组织中丙二醛含量的影响发现，MDA含量在暴露前期达到最大，随着暴露时间的延长逐渐减小，最终MDA含量降低到基本与空白组相当，与本研究MDA变化趋势一致。

2.4 PFOA对斑马鱼头部AchE活性的影响

乙酰胆碱酯酶(AchE)是一种与生物神经传导有关的酶，是反映水生生物受到外界胁迫危害程度的毒理学指标之一[21]，AchE广泛存在于各种动物组织中，在神经突触间隙中，通过催化水解神经递质乙酰胆碱来终止其对胆碱受体的兴奋作用，维持神经冲动的正常传递，其活性升高则会抑制兴奋的传递，活性降低则表现为过度兴奋，无论其活性升高或者降低都会影响斑马鱼正常的生理生化功能[22-23]。各暴露组PFOA对斑马鱼头部AchE活性的影响见图4。

图4 各暴露组PFOA对斑马鱼头部AchE活力的影响Fig.4 Effects of PFOA in each exposed group on AchE activity in zebrafish head

由图4可知，随着暴露时间的增长，PFOA对斑马鱼头部AchE活性表现为先诱导后抑制，斑马鱼暴露于PFOA后到实验第9 d，各浓度组斑马鱼头部AchE活力均随着暴露时间的增长而增加，PFOA对AchE活性表现为诱导作用。其中，5 mg/L暴露组在第3 d和第6 d显著高于空白组(P<0.05)；但暴露的第12 d，5，15 mg/L浓度组斑马鱼头部AchE活性高于对照组，但45，135 mg/L浓度组AchE活性显著低于空白组(P<0.01)，即低浓度的PFOA促进了AchE活性，高浓度的PFOA抑制了AchE活性。暴露至第15 d，5，15，45 mg/L浓度组与空白组相比AchE活性受到显著抑制(P<0.01)，分析原因，PFOA具有神经毒性，对斑马鱼神经系统有破坏作用，导致神经突触间隙中乙酰胆碱数量减少，从而抑制了兴奋的传递。但到第12 d以后，浓度大于45 mg/L的PFOA抑制AchE活力，AchE活力降低，这可能是高浓度的PFOA破坏了神经递质的传导，表现出明显的时间-剂量关系。Guo等[24]通过研究全氟化合物对斑马鱼的神经毒性效应发现，PFDoA破坏神经递质系统(包括胆碱能和多巴胺信号系统)、抑制神经元发育，与本文中PFOA通过诱导AchE活性，间接影响神经递质乙酰胆碱的数量，破坏神经递质系统结论相一致。

3 结论

(1)本研究发现PFOA可以引起斑马鱼产生氧化应激反应，并呈现出时间-效应关系和剂量-效应关系。暴露期间ROS与MDA含量变化呈现正相关性，但ROS、MDA含量变化与SOD活力变化呈现“相反”趋势。

(2)PFOA对斑马鱼体ROS具有诱导作用，且高浓度的PFOA对斑马鱼ROS诱导作用更显著。MDA含量在暴露第6 d达到最大，并随着暴露时间的延长逐渐减小，最终MDA含量降低到基本与空白组水平相当，该变化与ROS变化相一致，充分证明ROS与MDA含量变化呈现正相关性。

(3)在暴露前9 d，PFOA对斑马鱼体内SOD活力表现为先抑制后诱导的作用，鱼体内SOD活力与ROS与MDA含量呈现负相关性。但暴露至12 d以后，低浓度暴露组斑马鱼SOD活力可恢复至空白组水平，高浓度暴露组SOD活力仍受到显著抑制。

(4)PFOA具有神经毒性，通过诱导AchE活性，使斑马鱼神经突触间隙中乙酰胆碱数量减少，从而抑制兴奋的传递。在整个暴露周期内，随着暴露时间的增长，PFOA对斑马鱼头部AchE活性表现为先诱导后抑制。