沉默miRNA210可能通过低氧诱导因子-血管内皮生长因子途径减轻心肌炎时心肌细胞的损伤

李海文，杨志明，高福萍，张瑞琴，柴蝉娟

1山西医科大学第二医院心内科，太原 030001 2中国科学院高能物理研究所纳米生物效应与安全性研究室，北京 100049

心肌炎是一种与心功能不全相关的心肌炎症性疾病，可通过组织病理学、免疫学和免疫组织化学来诊断[1]。心肌炎由多种病因引起，会导致心脏功能障碍，并可降低收缩和舒张功能及引起心律失常，常由感染、过敏反应或免疫相关损伤引起[2]。细菌性心肌炎通常由细菌直接感染心肌或由细菌对心肌产生的毒素作用或细菌产物引起的过敏反应引起，虽然致病因子多样，但引起细菌性心肌炎的病原体主要是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、肺炎球菌和脑膜炎奈瑟菌等。细菌性心肌炎的临床表现往往取决于病变的程度，病变较轻可能没有症状，但严重者可能会造成患者猝死。目前关于心肌炎的发病机制尚不清楚，因此加强心肌炎的研究具有重要意义。

miRNA是20～26个核苷酸组成的小分子，具有保守的单链编码RNA序列[3]，参与机体调节功能，如细胞增殖、分化、凋亡、血管生成、肿瘤形成和造血等[4]。研究表明，miRNA210是一种缺氧诱导的miRNA，在细胞面临缺氧环境时上调，可在缺氧相关现象中发挥作用，如血管生成、细胞凋亡、分化、增殖、细胞周期调控、线粒体代谢、DNA损伤修复和肿瘤生长[5]。miRNA也存在于细胞分泌的外泌体中，作为干细胞-外泌体miRNA的一种，miRNA210可通过增强心肌细胞存活和功能及减弱心脏纤维化而具有心脏保护作用[6]，能在多种低氧组织和细胞中表达，并在低氧环境中受到低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF1)的调节。本研究观察了miRNA210在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导心肌炎时对于心肌细胞大鼠原代心肌的作用及其内在机制。

材料和方法

材料ELISA试剂盒购自锐博生物技术有限公司，凋亡试剂盒(货号：556547)购自美国BD公司，抗(大鼠)bcl- 2(3498T)、bax(2772T)、caspase- 3(9662S)、HIF1(36169T)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体购自德国CST公司，DMEM和FBS三抗培养基购自碧云天生物技术有限公司，2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol，2ME)购自美国Selleck公司。

大鼠原代心肌细胞的分离提取和分组用于分离原代心肌细胞的3 d新生SD大鼠购自军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号码：SCXK-(军)2012- 0004。 SD大鼠经尾静脉注射麻醉剂后取心房和心室，采用胶原酶Ⅰ(美国Sigma-Aldrich公司)将心脏组织解离为单细胞悬液。将分离的细胞置于含20%FBS、美国洛根和抗生素(100 U/U)的DMEM培养基(美国Gibco公司)中培养。在6孔板中以铺板密度为5×105/ml，37℃、5% CO2条件下培养48 h。随后用心肌细胞特异性标记辅肌动蛋白α2(recombinant actinin alpha 2，ACTN2)的抗体进行免疫荧光染色鉴定。大鼠原代心肌分为以下4组：(1)对照组：离体培养的心肌细胞中滴加生理盐水100 μl；(2)LPS组：离体培养的心肌细胞中滴加10 μmol/L LPS 100 μl；(3)LPS+miRNA210 mimic组：离体培养的心肌细胞中滴加10 μmol/L LPS 100 μl和miRNA210 mimic 100 μl；(4)LPS+miRNA199a siRNA组：离体培养的心肌细胞中滴加10 μmol/L LPS 100 μl和miRNA199a siRNA 100 μl。

CCK8法观察细胞活力细胞铺板贴壁后进行siRNA感染，感染24 h后，进行100 nmol/L模拟物药物干预及10 μmol/L LPS干预，24 h时采用CCK8(日本同仁公司)法于450 nm波长处测量吸光度。

ELISA法测量大鼠原代心肌细胞白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α含量干预处理后，收集各组大鼠原代心肌细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。随后在酶标仪450 nm波长处测量标准品及样品。

流式细胞仪检测大鼠原代心肌细胞凋亡率细胞铺板后进行干预处理24 h，收集上清，无EDTA胰酶消化收集细胞沉淀后，用200 μl AV Buffer重悬；取30 μl，加入5 μl AV抗体10 μl避光，常温孵育30 min。上机前，孵育PI，上机测量凋亡率。

Western blot检测各凋亡蛋白及内在通路HIF1-VEGF蛋白表达情况细胞铺板干预处理后，提取蛋白裂解液后，15000 r/min(r=15 cm)离心15 min，取上清与上样缓冲液按5×比例混合后置于100℃水浴锅中使蛋白变性10 min，进行蛋白凝胶电泳及显像分析。

统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

大鼠原代心肌细胞活力检测结果CCK8法检测结果显示，经过miRNA210模拟物和siRNA干预后，大鼠原代心肌细胞活力分别为(0.32±0.02)%(t=0.000，P=1.000)和(0.51±0.01)%(t=0.686，P=0.500)，与对照组的(0.89±0.02)%差异无统计学意义。对照组、LPS组、LPS+miRNA210 mimic组和LPS+miRNA199a siRNA组的心肌细胞活力分别为(0.89±0.02)%、(0.23±0.01)%、(0.18±0.01)%和(0.42±0.02)%，其中，LPS组低于对照组(t=8.764，P<0.001)，LPS+miRNA210 mimic组低于LPS组(t=6.995，P<0.001)，LPS+miRNA199a siRNA组高于LPS+miRNA210mimic组(t=3.576，P=0.012)。

心肌细胞炎症因子的表达情况ELISA检测结果显示，对照组、LPS组、LPS+miRNA210 mimic组、LPS+miRNA199a siRNA组的白细胞介素(interleukin，IL)- 1β和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α表达水平分别为(20.15±2.25)和(6.85±1.16)、(42.09±2.56)和(20.18±1.76)、(64.32±5.67)和(31.46±3.09)、(31.02±3.07)pg/ml和(12.96±2.12)pg/ml。其中，LPS组的IL- 1β(t=4.166，P=0.014)和TNF-α(t=6.309，P=0.003)表达水平明显高于对照组，LPS+miRNA210 mimic组的IL- 1β(t=4.096，P=0.015)和TNF-α(t=4.424，P=0.011)表达水平明显高于LPS组，LPS+miRNA199a siRNA组的IL- 1β(t=4.287，P=0.012)和TNF-α(t=3.577，P=0.023)水平明显低于LPS组。

大鼠原代心肌细胞凋亡情况流式细胞凋亡实验检测结果显示，对照组、LPS组、LPS+miRNA210 mimic组和LPS+miRNA199a siRNA组的细胞凋亡率分别为(20.31±2.61)%、(50.24±2.59)%、(64.60±3.94)%和(33.78±3.27)%，其中，LPS组的凋亡率明显高于对照组(t=32.780，P<0.001)，LPS+miRNA210 mimic组明显高于LPS组(t=7.412，P=0.002)，LPS+miRNA199a siRNA组明显低于LPS组(t=11.720，P<0.001)(图1)。

图1 大鼠原代心肌细胞的凋亡情况

大鼠原代心肌细胞凋亡蛋白的表达情况Western blot检测结果显示，对照组、LPS组、LPS+miRNA210 mimic组和LPS+miRNA199a siRNA组的bcl- 2相对表达水平分别为1252.69±96.79、521.82±50.39、320.18±35.77和856.32±72.10，bax相对表达水平分别368.27±36.95、892.36±72.69、1120.85±90.26和612.85±52.10，caspase- 3相对表达水平分别268.76±30.27、650.12±55.39、811.96±62.30和429.86±39.65。其中，LPS组的bcl- 2表达明显低于对照组(t=8.346，P=0.001)，bax(t=12.890，P<0.001)和caspase- 3表达(t=4.331，P=0.012)明显高于对照组；LPS+miRNA210 mimic组的bcl- 2表达明显低于LPS组(t=6.074，P=0.003)，bax(t=5.376，P=0.022)和caspase- 3表达(t=5.859，P=0.004)明显高于LPS组；而LPS+miRNA199a siRNA组bcl- 2表达明显高于LPS组(t=3.873，P=0.017)，bax(t=5.205，P=0.006)和caspase- 3表达(t=2.800，P=0.040)明显低于LPS组。对照组、LPS组、LPS+miRNA210 mimic组、LPS+miRNA199a siRNA组的HIF1和VEGF相对表达水平分别为456.58±49.85和526.86±55.29、1119.71±85.99和901.20±75.12、1589.65±129.71和1123.80±102.57、685.63±60.20和650.12±56.05。其中，LPS组的HIF1(t=10.380，P=0.001)和VEGF表达(t=4.973，P=0.008)明显高于对照组，LPS+miRNA210 mimic组的HIF1(t=8.952，P=0.001)和VEGF表达(t=11.203，P=0.001)明显高于LPS组，LPS+miRNA199a siRNA组的HIF1(t=3.893，P=0.017)和VEGF表达(t=3.181，P=0.033)明显低于LPS组(图2)。

VEGF：血管内皮生长因子；HIF1：低氧诱导因子1

HIF1抑制剂2ME对大鼠原代心肌细胞凋亡蛋白表达的影响2ME应用后逆转了miRNA210模拟物的加重性效应，LPS+miRNA210 mimic+2ME的bax(t=4.899，P=0.008)、HIF- 1α(t=2.833，P=0.047)、caspase- 3(t=2.877，P=0.045)和VEGF(t=2.994，P=0.040)表达明显低于LPS组，bcl- 2表达明显高于LPS组(t=3.392，P=0.017)(图3)。

图3 HIF1抑制剂2ME可以抑制miRNA210对LPS诱导大鼠原代心肌细胞凋亡蛋白的影响

讨 论

HIF1是调节基因表达以响应氧水平降低(缺氧)的转录因子[7]。在常氧状态下，HIF1可以被脯氨酸羟化酶降解，因而在常氧下HIF1的表达水平降低[8]。一旦机体遭受损伤、炎症等引起缺血缺氧状态，机体内脯氨酸羟化酶即可被降解进而引起HIF1表达升高，随后激活HIF1下游调控序列。有研究表明，在遭受辐射诱导的肠道损伤后，HIF1可以抑制凋亡相关蛋白表达，保护肠道上皮细胞免遭损伤[9]，表明HIF1在凋亡的发生发展中扮演重要的作用。但目前在心血管系统中关于HIF1调控的凋亡损伤少有研究。有研究表明，在DSS诱导的小鼠肠炎中，敲除HIF1后肠道上皮细胞凋亡更加严重[10]，提示HIF1可能对于凋亡蛋白的调控具有重要作用。

人VEGF基因全长14kb，由8个外显子和7个内显子组成。VEGF经剪切后可以分为VEGF145、VEGF165、VEGF121、VEGF189和VEGF206 5个异构体。目前发现的VEGF受体有VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、NP- 1和NP- 2共 5种[11]。VEGFR2是VEGF发挥生物学作用的主要受体，当VEGF与VEGFR2结合后导致自身磷酸化位点被磷酸化进而介导下游目的基因的转录，从而对机体细胞增殖、血管生成和细胞存活产生重要影响[12]。最近研究表明，LPS诱导血管内皮细胞的凋亡是通过下调VEGFR实现的，其介导了bcl- 2、bax等相关凋亡蛋白的表达[13]。心肌细胞均表达HIF1与VEGF蛋白，Mathew等[14]研究认为，上调细胞内的HIF1可以促进VEGF的表达，提示HIF1-VEGF通路可能在心肌炎中扮演重要的作用[15]。心肌炎发生时，心肌细胞可能处于炎性渗出、耗氧量增加、心肌缺血等状态，最终导致心肌细胞损伤，心肌细胞凋亡增加，引发恶性临床事件。

近来研究发现，miRNA在心血管事件中可发挥重要作用，miRNA介导的心肌细胞损伤也被广泛地进行研究。本研究结果显示，miRNA210可以抑制心肌炎心肌细胞的活力，因此我们推测miRNA210在心肌炎进展时是一个不良信号。本研究还发现，在心肌炎发生时，miRNA210不仅可以促进心肌细胞的凋亡，还可进一步促进IL- 1β和TNF-α等炎症因子的渗出，表明miRNA210不仅是一种不良信号，更是一种加重损伤的警示，miRNA210可能介导了心肌炎时心肌细胞的凋亡过程，促进了心肌细胞不可逆的损伤。此外本研究结果显示，在心肌炎时，缺血、缺氧或炎症状态可以上调HIF- 1α的表达，HIF- 1α在心肌炎时具有重要的研究意义。不仅如此，miRNA210还可以上调凋亡蛋白caspase- 3和bax的表达，下调bcl- 2蛋白的表达，并抑制HIF1介导的VEGF表达，表明沉默miRNA210可能是通过HIF1-VEGF途径减轻心肌炎时心肌细胞的损伤。