瞬时感受器电位M7在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型体内的表达与淋巴细胞的相关性分析

王秋洁 卜诗益 唐恬恬 欧阳文浩 陈茗 石健庭 黄林洁 林小玲

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以不完全可逆气流受限为特征的呼吸系统疾病，其病因及发病机制复杂，至今尚未完全明确。T 淋巴细胞通过产生多种炎症因子参与免疫反应，在COPD 气道炎症及重塑过程中扮演重要角色。

瞬时感受器电位 M7（Transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）具有离子通道和蛋白激酶双重结构和双重功能。既往研究发现TRPM7 在长期烟草暴露大鼠的气道平滑肌细胞表达增多且影响其增殖与分泌功能，可能在COPD 中发挥重要作用［1］。TRPM7 是T 淋巴细胞表面重要的离子通道，对淋巴细胞的生长、增殖、迁移活化等功能有重要作用［2，3］。因此我们推测TRPM7 可能通过影响淋巴细胞的生物学功能参与COPD 的发生发展。

1 材料和方法

1.1 动物清洁级雄性SD 大鼠，6～8 周龄，250 g±20 g，动物实验方案已获中山大学实验动物伦理委员会审批。

1.2 主要试剂LPS 购自美国Sigma 公司，大前门牌香烟烤烟型（焦油量15 mg，气烟碱量1.1 mg）产自上海烟草集团；RPMI 1640 培养基、胎牛血清、PBS购自美国Gibco公司；PCR试剂购自日本Takara公司；HE 染色试剂盒购自北京Solarbio 公司；e450、抗CD3、抗CD8 流式抗体及抗CD3/CD28 抗体刺激剂购自美国BD 公司；CCK⁃8 试剂盒购自上海Beyotime 公司；凋亡试剂盒购自美国Invitrogen 公司；所用引物由北京BGI公司设计合成。

1.3 主要方法（1）大鼠COPD 模型的构建将20只SD 大鼠随机分为2 组，对照组和COPD 模型组，建模方法如图1⁃A 所示，每次熏烟30 min，每日2次，对照组予生理盐水处理。每日测量大鼠体重，末次烟熏后取材进行检测。（2）肺、脾组织病理学检测肺、脾组织固定后包埋切片、HE 染色及拍片。（3）流式检测CD3+CD8+T 淋巴细胞。（4）RT⁃qPCR 检 测 肺、脾 组 织mRNA，用2⁃ΔΔCT方 法 计 算mRNA 相对表达水平，以β⁃actin 为内参，mRNA 引物序列见表1。（5）2⁃APB 体外干预大鼠脾淋巴细胞将大鼠脾脏研磨为单个细胞，经淋巴细胞分离液分离后计数种板，分为6 组，对照组：不加任何处理；激活组：加抗CD3/CD28 抗体；溶剂对照组：加抗CD3/CD28 抗体及溶剂甲醇；6.25 μM、12.5 μM、25 μM 2⁃APB 组：加抗CD3/CD28 抗体及不同浓度2⁃APB。（6）CCK⁃8 检测脾淋巴细胞的增殖功能。（7）流式检测脾淋巴细胞的凋亡情况。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.4 统计学处理所有实验均进行3 次，采用SPSS22.0 软件包进行统计学分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 气管内滴注LPS 联合烟熏诱导大鼠COPD模型的构建相比对照组大鼠，COPD 组大鼠体重减低（P<0.05）见图1⁃B，毛发发黄，肺体积明显增大伴有灰褐色物质沉积，脾组织萎缩，见图1⁃C。HE 染色示COPD 组大鼠支气管黏膜上皮脱落，气管壁大量炎症细胞浸润，肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄或断裂，肺泡腔扩大，见图2⁃A；脾组织淋巴滤泡萎缩，淋巴细胞明显减少，纤维结缔组织增生，见图2⁃B。以上结果表明气管内滴注LPS 联合烟熏诱导大鼠COPD 模型构建成功。

图1 气管内滴注LPS 联合烟熏诱导大鼠COPD 模型的建立

图2 COPD 大鼠模型肺、脾组织形态学特征

2.2 COPD 大鼠模型肺组织TRPM7 表达及相关性分析与对照组大鼠相比，COPD 组大鼠肺组织中TRPM7 和CD8 mRNA 表达明显减少（P<0.05），而CD4、TGF⁃β1、TGF⁃βR1 及TGF⁃βR2 mRNA 表达明显增加（P<0.05），见图3⁃A/B。相关性分析结果显示TRPM7 mRNA 与CD8 mRNA 成正相关关系，相关系数为0.5652，P值为0.0352（P<0.05），而与CD4、TGF⁃β1、TGF⁃βR1 及TGF⁃βR2 mRNA 无相关关系，见图3⁃C。

图3 COPD 大鼠模型肺组织TRPM7 表达及相关性分析

2.3 COPD 模型脾组织TRPM7 表达及相关性分析与对照组大鼠相比，COPD 组大鼠脾组织中TRPM7 和CD8 mRNA 表达明显减少（P<0.05），而CD4、TGF⁃β1 及TGF⁃βR2 mRNA 表达明显增加（P<0.05），TGF⁃βR1 mRNA 表达差异无统计学意义，见图4⁃A/B。相关性分析结果显示TRPM7 mRNA 与CD8 mRNA 成正相关关系，相关系数为0.5313，P 值为0.0282（P<0.05），而与CD4、TGF⁃β1、TGF⁃βR1及TGF⁃βR2 mRNA无相关关系，见图4⁃C。

图4 COPD 大鼠模型脾组织TRPM7 表达及相关性分析

2.4 2⁃APB 对大鼠脾细胞凋亡增殖功能的影响流式结果示血液及脾脏中CD3+CD8+T 淋巴细胞比例分别为18.11%、58.32%，见图5⁃A。2⁃APB 体外干预大鼠脾淋巴细胞，凋亡检测结果示相比于溶剂对照组，25 μM 2⁃APB 组的凋亡率明显增加（P<0.05），见图5⁃B；增殖检测结果示与溶剂对照组相比，不同浓度2⁃APB 刺激脾细胞后可减弱脾细胞的增殖能力，2⁃APB 浓度越高，作用越明显，25 μM 2⁃APB 可完全抑制脾细胞的增殖（P<0.05），见图5⁃C。

图5 2-APB 对大鼠脾细胞凋亡增殖功能的影响

2.5 2⁃APB 对大鼠脾CD3+CD8+T 淋巴细胞比例的影响2⁃APB 体外干预大鼠脾淋巴细胞后，流式结果示相比于溶剂对照组，6.25 μM 2⁃APB 组、12.5 μM 2⁃APB 组及25 μM 2⁃APB 组的CD3+CD8+T 淋巴细胞明显减少（P<0.05），见图6。

图6 2-APB 对大鼠脾CD3+CD8+T 淋巴细胞的影响

3 讨 论

本研究中，我们发现TRPM7 在LPS 联合烟熏诱导的COPD 模型大鼠肺、脾组织内表达减少，与CD8+T 淋巴细胞表达减少存在相关性。2⁃APB 体外干预TRPM7 功能影响脾淋巴细胞增殖、凋亡及分化，减少CD8+T 淋巴细胞比例。

TRPM7 广泛存在于体内并参与细胞内多种重要生理过程。Fang 等［4］发现TGF⁃β1 刺激肝星状细胞后可通过Smad3 通路增加TRPM7 的表达进而增加胶原纤维的表达。Jin 等［5］研究发现Trpm7⁃/fl小鼠的胸腺细胞中CD4-CD8-T 淋巴细胞比例明显高于野生型小鼠，阻碍了T 细胞的分化。我们的研究结果提示TRPM7 可能通过调节CD8+T 淋巴细胞的比例从而参与COPD 的发展，但具体机制仍有待进一步研究。

在不同研究中，COPD 体内T 淋巴细胞亚群比例存在明显差异。本实验中COPD 大鼠肺、脾组织中CD8+T 淋巴细胞比例下降，而CD4+T 淋巴细胞比例增加，可能与LPS 联合烟熏诱导大鼠的细胞免疫功能增加而体液免疫功能下降有关。而Hogg等［6］发现COPD 患者肺组织CD4+T 与CD8+T 淋巴细胞表达增加。Hodge 等［7］发现烟草暴露小鼠血液及肺组织中CD8+T 淋巴细胞增加。Zhou 等［8］发现烟草暴露小鼠肺组织中CD4+T 淋巴细胞减少而CD8+T 淋巴细胞增加。吴红科等［9］发现COPD 患者肺组织中CD4+T 及CD8+T 淋巴细胞的表达均明显下降。张鸽等［10］的研究表明LPS 联合烟熏诱导的COPD 小鼠脾脏中CD4+T 与CD8+T 淋巴细胞比例均较对照组明显减少。这些实验结果的差异可能与实验对象、造模方式、检测部位和实验方法的不同有关。