hrHPV E6/E7 mRNA载量水平与宫颈癌前病变的相关性分析

郭晨辉 徐小晶 孔薇 项敏

宫颈癌前病变即宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是有癌变倾向，在数年至数十年期间有可能发展为宫颈癌的病变［1-2］。已有研究显示［3-4］，高危型人乳头瘤病毒（high-risk human papillomavirus，hrHPV）持续感染是导致宫颈癌变的主要危险因素，宫颈癌患者中hrHPV 阳性率高达85%～90%。HPV 基因组包括早期区、晚期区和非编码区，其中早期区基因E6 和E7 可以参与病毒自身的复制、转录、翻译等过程，在宫颈癌变中发挥了最主要的作用，可用于宫颈癌的鉴别诊断［5］。既往研究采用定性检测分析了hrHPV E6/E7 mRNA阳性表达与CIN 和宫颈癌之间的关系，及其对CIN和宫颈癌的鉴别诊断［6］。但hrHPV E6/E7 mRNA 载量对CIN 的诊断价值，及其与CIN 病变程度之间的关系报道较少。因此，本研究定量分析了hrHPV E6/E7 mRNA 载量与CIN 病变之间的关系，旨在为宫颈癌的预防和治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2016年12月到2019年6月本院确诊的176 例宫颈病变患者，其中CIN 组144 例，宫颈癌组32例。CIN 组患者年龄25～60 岁，平均（40.87±7.62）岁，经产妇98 例，未产妇46 例，根据CIN 分级［7］：CINⅠ级62 例，CINⅡ级45 例，CINⅢ级37 例。宫颈癌组患者年龄28～60 岁，平均（42.53±8.46）岁，经产妇24 例，未产妇8 例。另取同期50 例慢性宫颈炎患者为慢性宫颈炎组，年龄25～60 岁，平均（40.54±8.21）岁，经产妇32 例，未产妇18 例。3 组间的年龄、经产次比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

纳入标准：均经阴道镜下组织病理学检查和宫颈液基薄层细胞学（thinprep cytology test，TCT）检测确诊，符合《宫颈癌防治指南》中CIN 和宫颈癌的诊断标准［8］；均未经接受过放化疗治疗，经医院伦理委员会审核通过。排除标准：妊娠期、月经期或哺乳期患者；存在宫颈手术史；入组前2 周内服用相关抗病毒药物；合并其他系统恶性肿瘤患者；合并其它免疫系统疾病者；临床资料不完整者。

1.2 方法

①检查前3 d 不能性生活、阴道用药或阴道冲洗，避开月经期。将TCT 专用刷伸入子宫颈内，顺时针旋转3～5 周，收集宫颈脱落上皮细胞，置于采样瓶中，用于TCT、hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7mRNA 检测。②TCT 检测：使用全自动细胞制片机制片，参考2001年TBS 分级系统［9］，包括NSIL：无上皮病变或恶性改变；ASC-H：不典型鳞状细胞；ASC-US：意义不明的非典型鳞状细胞；LSIL：低级别鳞状CIN；HSIL：高级别鳞状CIN；SCC：鳞状细胞癌。③hrHPV DNA 检测：采用第二代捕获杂交法（hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ）（美国凯杰公司）检测13 种hrHPV DNA 表达，相对光单位/临床阈值（relative light units/cut off，RLU/CO）表示HPV 病毒载量，重复检测2 次取均值。④hrHPV E6/E7 mRNA 检测：采用支链DNA（Branched-DNA，bDNA）信号扩增法（科蒂亚生物技术公司）检测14 种hrHPV E6/E7 mRNA 水平，严格按照试剂盒说明操作。重复检测2 次取均值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，满足正态分布的计量资料均以（±s）表示，单因素方差分析比较多组间差异，SNK-q比较多组两两间差异；ROC 分析hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA载量对CIN 的诊断价值；Pearson 相关性分析hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量与CIN 病变程度之间的相关性；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 载量比较

CIN 组和宫颈癌组患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量高于慢性宫颈炎组（P＜0.05），CIN 组患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量低于宫颈癌组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA载量比较（±s）Table 1 Comparison of hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load in each group（±s）

表1 各组患者的hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA载量比较（±s）Table 1 Comparison of hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load in each group（±s）

注：与慢性宫颈炎组相比，aP＜0.05；与宫颈癌组相比，bP＜0.05。

组别CIN 组宫颈癌组慢性宫颈炎组F 值P 值n 144 21 50 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.76±0.55ab 2.12±0.70a 1.44±0.46 14.871＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］3.04±0.96ab 4.21±1.34a 1.86±0.61 60.372＜0.001

2.2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量对CIN 的诊断价值

hrHPV E6/E7 mRNA 在CIN 与慢性宫颈炎鉴别诊断中AUC 为0.816，95%CI为0.719～0.913，具有统计学意义（P＜0.05），hrHPV DNA 载量在CIN与慢性宫颈炎鉴别诊断中AUC 为0.561，无统计学意 义（P＞0.05）；hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量在CIN 与宫颈癌鉴别诊断中AUC 分别为0.736 和0.698，95%CI分别为0.664～0.808 和0.615～0.780，具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.3 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量与宫颈细胞学TBS 分级的关系

随着TBS 分级增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量呈升高趋势（P＜0.05），HSIL 组和宫颈癌组的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA载量高于ASC 组、LSIL 组和NSIL 组；ASC 组和LSIL 组 的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量高于NSIL 组（P＜0.05）。宫颈癌组和HSIL 组间差异无统计学意义（P＞0.05），ASC 组和LSIL 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量与TBS 分级的关系（±s）Table 2 relationship between hrHPV E6/E7 mRNA and hrHPV DNA load and TBS grading（±s）

表2 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量与TBS 分级的关系（±s）Table 2 relationship between hrHPV E6/E7 mRNA and hrHPV DNA load and TBS grading（±s）

注：与NILM 相 比，aP＜0.05；与ASC 相比，bP＜0.05；与LSIL 相比，cP＜0.05。

TBS 分级NILM ASC LSIL HSIL SCC F 值P 值n 90 24 59 32 21 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.40±0.38 1.77±0.56a 1.82±0.57a 2.21±0.72abc 2.25±0.71abc 87.274＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］1.65±0.52 3.42±1.08a 3.54±1.12a 4.21±1.24abc 4.33±1.40abc 146.539＜0.001

2.4 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量与CIN 病变程度的关系

随着CIN 分级增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量呈升高趋势（P＜0.05），CINⅢ级患者的hrHPV E6/E7 mRNA 载量高于CINⅠ和CINⅡ期（P＜0.05），CINⅡ级的hrHPV E6/E7 mRNA 载量高于CINⅠ（P＜0.05），见表3。

表3 hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 载量与CIN 病变程度的关系（±s）Table 3 relationship between hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load and the degree of CIN lesions（±s）

表3 hrHPV E6/E7mRNA 和hrHPV DNA 载量与CIN 病变程度的关系（±s）Table 3 relationship between hrHPV E6/E7mRNA and hrHPV DNA load and the degree of CIN lesions（±s）

注：与CINⅠ级相比，aP＜0.05；与CINⅡ级相比，bP＜0.05。

CIN 分级CIN Ⅰ级CIN Ⅱ级CIN Ⅲ级）F 值P 值n 62 45 37 hrHPV DNA［lg（RLU/CO）］1.52±0.48 1.78±0.53a 2.03±0.65ab 10.460＜0.001 hrHPV E6/E7 mRNA［lg（copies/mL）］2.01±0.62 3.24±1.02a 4.12±1.13ab 66.826＜0.001

2.5 hrHPV E6/E7 mRNA 和hrHPV DNA 载量与CIN 病变程度之间的相关性关系

Pearson 相关性分析显示，hrHPV E6/E7 mRNA和hrHPV DNA 载量均与CIN 病变程度呈正相关（r=0.285，0.621；P＜0.05）。

3 讨论

CIN 是宫颈非典型增生，hrHPV 持续感染是导致CIN 发展为宫颈癌的最主要因素。既往研究常采用hrHPV 感染来辅助临床宫颈癌的筛查，灵敏度高，可以作为宫颈癌初筛工具之一［10］。然而近年来研究显示［11］，只有宫颈上皮细胞的hrHPV 持续性感染可能诱发宫颈癌变，而单纯一过性hrHPV 感染很难诱导宫颈恶性肿瘤的形成。hrHPV 持续感染受HPV 病毒的亚型、癌基因活跃程度、宿主免疫应答等多种因素影响，单纯的hrHPV 检测无法区分hrHPV 的感染状态，对于宫颈病变的诊断、严重程度评估具有一定的局限性［12］。HPV 基因组的调控功能主要由E 区基因（E1、E2、E4、E5、E6 和E7）编码，其中E6 基因编码的E6 蛋白可以调节癌基因p53 的表达，发挥致癌作用，而E7 基因编码的蛋白可以降解Rb，释放E2F 转录因子，诱导细胞恶性增殖［13］。Fan 等的研究显示［14］，E6/E7 基因的转录、翻译是调节HPV 感染诱导宫颈癌变的重要基因，可以反映病毒癌基因的活性，在宫颈癌筛查中具有重要的应用价值。因此，本研究定量分析了hr-HPV E6/E7 mRNA 载量与CIN 病变之间的关系，旨在准确评估CIN 的发生发展，预防宫颈癌变的发生。

本研究中，CIN 组患者的hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 水平明显高于慢性宫颈炎组，且低于宫颈癌组，提示hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 水平与患者的宫颈癌变有关，有望应用于临床诊断。本研究中，随着TBS 分级增加，hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量呈上升趋势。TBS 分级是一种基于宫颈/阴道细胞学的诊断技术，根据宫颈细胞病变程度进行分级，在宫颈癌筛查中具有较高的特异性，但敏感性较低［15］。本研究结果提示hrHPV DNA 和hrHPV E6/E7 mRNA 载量与宫颈细胞病变程度有关，有望应用于临床宫颈病变的评估。

综上所述，hrHPV E6/E7 mRNA 对CIN 具有较高的诊断价值，且mRNA 载量与CIN 分级具有显著的相关性，可以用于CIN 的鉴别诊断和病变评估，指导临床预防和治疗工作的进行。本研究不足之处在于样本数量较少，且为单中心研究，可能会对结果产生一定的统计学误差，但本研究仍为CIN 的诊断和防治提供了一定的理论依据。