羊水穿刺在产前筛查无创高风险病例中染色体异常的产前诊断价值

刘慧 方慧琴 陈薇 严雅兰 袁静

我国每年新出生肉眼可见先天性畸形儿20 万～30 万，先天性出生缺陷儿总数高达100 万左右，是出生缺陷的高发国家［1］。染色体异常是造成新生儿出生缺陷的主要原因之一，可导致智力低下、多发畸形、发育迟缓、生育障碍等，且目前对染色体疾病，尚无有效的治疗手段，患儿娩出后，给家庭、社会带来沉重的心理、经济负担，因此产前筛查与诊断，对控制出生缺陷，提高人口质量意义重大［2］。近年来随着二代高通量测序技术的迅速发展，无创产前检测技术（Noninvasive prenatal test，NIPT）在临床得到广泛应用，已被证实具有较高的染色体异常检出率和较低的假阳性率，在产前筛查胎儿染色体异常中起到重要作用［3］。但由于NIPT 筛查结果受到孕妇自身、胎儿、胎盘等诸多因素的影响，准确率降低，故临床对NIPT 高风险人群，仍需采用羊水穿刺做进一步的诊断［4］。以往较多报道以羊水穿刺为“金标准”，围绕NIPT、羊水穿刺的一致性进行研究，而较少以临床随访结果为对照，验证羊水穿刺的诊断效能［5］。鉴于此本研究将探讨羊水穿刺在NIPT 高风险人群中的诊断价值，报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年12月本院收治的105 例产前筛查无创高风险病例，年龄20～45 岁，平均年龄（36.24±4.30）岁；孕周13～20 周，平均（18.54±1.60）周；初产妇63 例，经产妇42 例。本研究经我院伦理委员会审核批准，孕妇均知晓羊水穿刺的目的、可能存在的风险，自愿接受羊水穿刺检查，并签署知情同意书。

纳入标准：①接受规律产前检查孕妇；②产前筛查无创高风险孕妇；③自愿接受羊水穿刺者；④承诺可配合随访；⑤单胎妊娠；能获得新生儿随访结果者。排除标准：①产前筛查无创高风险，但拒绝行羊水穿刺者；②未获临床随访结果者；③有精神病史者；④认知功能障碍者；⑤无法进行正常沟通交流者；⑥凝血功能异常者；先兆流产者；⑦有宫腔或盆腔感染征象者，体温＞37.4℃者，有出血倾向者，入组前1年内有器官移植手术史者，近期有异体输血者；双胎妊娠者。

1.2 方法

1.2.1 NIPT 检测

采集清晨空腹肘部静脉血5 mL，10 000 rpm离心10 min，提取血浆中游离DNA，建库、测序，PCR 扩增，采用第二代高通量测序技术进行覆盖度测序，通过生物信息分析，得到各染色体Z 值。其中，13、18、21 号染色体Z 值在-3.0～3.0 范围内为低风险，超出该范围为高风险。其他染色体异常及性染色体异常依具体情况作为次要发现报告。

1.2.2 羊水穿刺-核型分析

NIPT 检测高风险者，给予遗传学咨询，在患者知情同意后，于孕18～30 周行羊膜腔穿刺术。抽取羊水20 mL，分装于两个无菌离心管内，常温下2 000 rpm 离心7 min，保留（0.5～1）mL 羊水细胞层接种于25 mL 无菌T 形培养瓶中，培养基与细胞液混匀后，培养箱中培养（37℃、5% CO2），第9 或10 d 观察生长情况，并更换新培养基，于细胞生长旺盛期收集羊水细胞，消化、低渗、预固定、一次和二次固定处理后滴片，G 显带，镜下观察，记录20 个分散良好中期分裂相，随机选取4 个进行分析，参考人类细胞遗传学国际命名体制标准（ISCN2013）进行核型分析。入组孕妇穿刺前均核查血型，若为Rh 阴性，而其配偶为Rh 阳性，介入性产前诊断穿刺后应立即注射抗RhD 免疫球蛋白。

1.2.3 临床随访

为减少失访，至少留取孕妇及家属2 个人员的电话，预产期后通过电话随访、查阅妇产科病例资料方式进行信息追踪，统计妊娠结局。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件处理数据，计量资料以（±s）表示，行t检验，计数资料用n（%）表示，用χ2检验，采用受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic，ROC）及ROC 下面积（Area under the curve，AUC）分析羊水穿刺-核型分析诊断总染色体异常的效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床随访结果

105 例产前筛查无创高风险病例，临床随访染色体异常83 例（79.05%），其中包括13-三体综合征9 例（10.84%），18-三体综合征13 例（15.66%），21-三体综合征51 例（61.45%），性染色体异常10 例（12.05%）。

2.2 羊水穿刺-核型分析检出各类型染色体异常情况

临床随访105 例羊水穿刺-核型分析检出各类型染色体异常情况。见表1。

表1 羊水穿刺-核型分析检出13-三体综合征情况（n=105）Table 1 Amniotic fluid puncture-karyotype analysis detected 13-trisomy syndrome（n=105）

2.3 分析羊水穿刺-核型分析诊断各类型染色体异常的效能

以临床随访结果为准，羊水穿刺-核型分析诊断各染色体异常的灵敏度、准确度、特异度比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 羊水穿刺-核型分析诊断各类型染色体异常的效能Table 2 Amniotic fluid puncture-karyotype analysis for diagnosis of various types of chromosomal abnormalities

2.4 羊水穿刺-核型分析检出总染色体异常情况

临床随访检出总染色体异常83 例，无染色体异常22 例；羊水穿刺-核型分析检出总染色体异常85 例，无染色体异常20 例。见表3。

2.5 分析羊水穿刺-核型分析诊断学染色体异常的效能

以临床随访结果为准，羊水穿刺-核型分析诊断总染色体异常的灵敏度为95.18%，特异度为72.73%，准确度为90.48%，见图1。

表3 羊水穿刺-核型分析检出总染色体异常的情况Table 3 Amniotic fluid puncture-karyotype analysis detected total chromosome abnormalities

3 讨论

传统唐氏筛查依据母体血清学指标、胎儿超声检查、孕妇年龄等对唐氏综合征发生风险进行分层，结果高危人群建议进行金标准检查，但由于技术上的局限性，存在检出率较低与假阳性率较高的缺点，可能发生漏诊、增加不必要的有创性产前诊断事件的风险［6］。NIPT 建立于孕妇外周血中胎儿游离DNA 于高通量测序技术之上，是一种无创性产前筛查手段，与传统唐氏筛查相比，能减少漏诊率，参考NIPT 决定是否实施羊水穿刺，可进一步降低有创性产前诊断的实施［7］。

21-三体综合征是21 号染色体数目异常导致的染色体病，60%患儿在胎内早期即流产，存活者有明显的特殊面容、智能落后、多发畸形、生长发育障碍［8］。朱长巍等［9］研究显示，羊水穿刺产前筛查孕妇21-三体综合征的灵敏度为94.12%、特异度为99.95%，本研究数据与之相近，证实羊水穿刺诊断21-三体综合征具有较高的客观参考价值。18-三体综合征发生率为活产新生儿的1/4 000～1/8 000，患儿多于生后不久死亡，存活者有严重智力障碍［10］。本研究发现，羊水穿刺-核型分析诊断18-三体综合征的效能较高，可为孕期遗传咨询提供有价值的参考。13-三体综合征新生儿中的发病率约为1∶25 000，女性明显多于男性，患儿的畸形和临床表现比21 三体性明显严重，脑和内脏的畸形非常普遍，还可见颅面的畸形、智力发育障碍等［11］。三体型的产生一般认为是在配子形成时或受精卵卵裂时出现染色体不分离，受精后形成单体型或三体型异常的子代［12］。采用羊水穿刺-核型分析能发现异常核型，帮助孕妇选择性分娩发育正常的胎儿。一项大型数据显示，产前性染色体异常阳性率为0.22%，NIPT 检测性染色体的准确率为73%，提示NIPT 存在漏诊与误诊［13］。

现阶段随着分子生物学检测技术的发展，胎儿染色体异常的检出率明显提高，虽然检测手段多样化，但均存在一定局限性，迄今为止无任何一项检测技术可完全取代羊水穿刺-核型分析。但作为一种侵入性产前诊断技术，具有一定的流产风险，致使很多产前高风险孕妇拒绝羊水穿刺，而错过最佳诊断时机［14］。而根据相关报道，孕中期行羊水穿刺，相关的胎儿丢失率为0.5%～0.86%，处于较低水平［15］。目前普通认同，产前羊水穿刺具有风险，但并不危险，因此临床上应加强对传统唐氏筛查、NIPT 高风险孕妇的健康宣教，提高其对羊水穿刺的认知度，从而能更好地配合产前染色体异常的筛查。本研究不足之处在于，病例数较少，有待后续扩大病例数或进行多中心研究，进行进一步的验证。

羊水穿刺对NIPT 高风险人群染色体异常具有较高的产前诊断价值，能为优生优育、遗传咨询提供可靠的参考，是产前诊断中不可替代的一种技术。