羊骨多肽酶法制备工艺优化及抗氧化活性研究

李晓叶张 珍王 琼王雪琦

(1. 甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070;2. 平凉市产品质量监督检验中心，甘肃 平凉 744000)

羊骨中的蛋白质含量高达18.6%，其中胶原蛋白占骨蛋白的90%左右[1]。但目前羊骨主要以非深加工方式用于鱼类、禽类等非反刍动物饲料的添加，利用率很低。

寻找一种天然、高效、低毒的抗氧化剂是现代科研中的一个热门课题[2]。国内外研究[3]发现，蛋白酶可将各类动植物源蛋白序列中具有抗氧化活性的片段(即抗氧化肽)酶解分离出来。这些用天然食品制备的抗氧化肽具有分子量小、易被机体吸收、高活性的特点，可以广泛应用于医药、食品、保健品等行业[4]。目前已有学者对羊骨胶原蛋白肽的酶解工艺及单酶水解羊骨粉效果比较等进行了研究，但未对其酶解液的抗氧化性进行深入研究。傅鑫森等[5]发现优化酶解工艺后得到的羊骨酶解物具有体外抗氧化活性，但未测定酶解物的还原力。

研究拟以羊骨为原料，用碱性蛋白酶对其进行酶解，优化酶解工艺，并对酶解液的抗氧化性进行测定，旨在为羊骨的深加工利用提供有效的参数支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜羊骨：来源于甘肃省甘南藏族自治州玛曲县欧拉乡的藏绵羊；

碱性蛋白酶：200 U/mg，上海源叶生物科技有限公司；

DPPH标准品：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；

四硼酸钠：分析纯，天津市光复科技发展有限公司；

十二烷基硫酸钠、焦性没食子酸、菲洛嗪：分析纯，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

pH计：PHS-3C型，上海宁隆仪器有限公司；

分析天平：FA2004B型，上海越平科学仪器有限公司；

台式高速冷冻离心机：H-1850R型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；

恒温搅拌水浴锅：HH-4A型，常州金坛精达仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊骨多肽的制备工艺流程

羊骨→冲洗→剔除大块肉筋→预煮(95 ℃，1 h)→高压蒸煮(120 ℃，1 h)→烘干(60 ℃，5 h)→脱脂(无水乙醇浸泡24 h)→脱钙(0.5 mol/L盐酸，浸泡24 h)→蒸馏水冲洗→烘干(60 ℃，5 h)→冷却→粉碎(过80目筛)→羊骨粉→羊骨粉加水预混合(45 ℃，10 min)→调节pH值→加入碱性蛋白酶酶解(酶解过程中每隔1 h调节一次酶解液的pH值，使其保持稳定)→灭酶(95 ℃，15 min)→离心(1 500 r/min，15 min)→上清液(酶解液)→测定水解度[6-7]

抗氧化试验中的对照组：不添加碱性蛋白酶，其他处理同羊骨粉的酶解处理。

1.3.2 碱性蛋白酶酶解羊骨粉的工艺优化 称取10 g羊骨粉与蒸馏水以1∶10 (g/mL)的比例在恒温磁力搅拌器上混合均匀展开羊骨粉酶解试验，操作如下：

(1) 酶解温度：固定酶解pH为9.0，酶添加量为8 000 U/g 羊骨粉，分别在30，35，40，45，50 ℃下水解5 h，考察酶解温度对羊骨粉水解度的影响。

(2) 加酶量：在确定温度的基础上，调节pH为9.0，加酶量分别为4 000，6 000，8 000，1 0000，12 000 U/g，水解5 h，考察加酶量对羊骨粉水解度的影响。

(3) 酶解时间：在确定酶解温度、加酶量的基础上，调节pH为9.0，设置酶解时间2，3，4，5，6 h，考察酶解时间对羊骨粉水解度的影响。

(4) 酶解pH：在确定酶解温度、加酶量、水解时间的基础上，设置pH为8.5，9.0，9.5，10.0，10.5进行酶解，考察酶解pH对羊骨粉水解度的影响。

(5) 响应面试验：根据单因素结果，选择酶解的时间、温度、加酶量和pH为影响因素，以水解度(DH)为响应值，利用四因素三水平响应面优化分析法优化工艺参数。

1.3.3 水解度的测定 采用OPA法[8]。

1.3.4 抗氧化性的测定

(1) DPPH自由基清除率：参照Tai等[9]的方法，修改如下：吸取2 mL样品与 DPPH—95%乙醇溶液相互混合，避光反应0.5 h，以3 000 r/min离心15 min，517 nm波长处测其吸光度，按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%；

As——2 mL样品与DPPH溶液的吸光度；

Ac——2 mL样品与2 mL 95%乙醇溶液的吸光度；

Ab——2 mL样品与DPPH—95%乙醇溶液的吸光度。

(2) 羟自由基清除率：依据Zhang等[10]的方法，修改如下：取1.0 mL样品置于试管内，先后加入邻二氮菲—乙醇、磷酸盐缓冲液、0.03%过氧化氢和FeSO4·7H2O，混匀，在37 ℃恒温条件下水浴1 h，冷却至室温，以4 000 r/min 离心10 min，于532 nm处检测吸光度为As，按式(2)计算羟自由基清除率。

(2)

式中：

C——羟自由基清除率，%；

As——样品组吸光度；

Ab——空白组吸光度；

An——损伤组吸光度(去离子水代替H2O2溶液)。

(3) 超氧阴离子自由基清除能力：参照文献[11]。

(4) 还原能力：参照文献[12]。

1.4 统计分析

采用Design-Expert 8.0.6开展响应面试验的设计及结果分析，利用IBM SPSS statistics 22.0软件统计分析，借助Origin 8.5绘制图形。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

如图1所示，酶解时间选择5 h，反应温度选择45 ℃，考虑经济效益，加酶量选择8 000 U/g，酶解pH选择10较为适宜。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计及结果分析 由单因素试验结果，选择酶解的时间、温度、加酶量和pH值四因素(见表1)，利用Box-Behnken中心组合原理设计四因素三水平的响应面试验，设计及结果见表2。

利用Design-Expert 8.0.6软件对水解度与各响应变量进行回归拟合后得各因素与响应值关系的函数：

表1 Box-Behnken试验因素水平表

表2 响应面试验的设计及结果

R=27.81+0.58A+1.60B+0.87C+1.20D-0.61AB+0.66AC-0.77AD-1.76BC-1.59BD-0.88CD-3.09A2-3.41B2-2.37C2-2.55D2。

(3)

对模型进行方差分析，结果见表3。

由图2、3可知，酶解时间和酶解温度以及酶解时间和加酶量的交互作用均对水解度影响显著；酶解pH和酶解时间的交互作用对水解度的影响不显著；酶解温度和加酶量以及酶解温度和酶解pH的交互作用均对水解度影响极显著(P<0.01)；加酶量和酶解pH的交互作用对水解度的影响显著。

2.2.2 模型验证 通过响应面软件分析得到碱性蛋白酶酶解羊骨粉的优化工艺参数为酶解时间5.09 h，酶解温度45.80 ℃，加酶量8 213.17 U/g，酶解pH值为10.08，该条件下水解度预测值为28.11%。考虑到试验的可行性，调整最优工艺条件为酶解时间5 h，酶解温度45 ℃，加酶量8 200 U/g，酶解pH 10，并进行验证实验(n=3)，其实测水解度为(28.36±0.02)%。说明采用响应面法优化碱性蛋白酶水解羊骨粉工艺模型可行。

2.3 羊骨酶解物的抗氧化性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由图4可知，随着酶解液质量浓度的增加，其DPPH自由基所具有的清除能力也逐渐提升。酶解液与对照组的IC50分别为0.90，10.75 mg/mL，说明酶解液DPPH自由基清除能力相比羊骨粉溶解液(对照组)有明显提升(P<0.05)，可能与羊骨酶解形成的小分子多肽相关。根据相关研究[13]可知，在溶液和溶质或固相与气相的界面，小分子多肽将会产生一种薄膜，从而对目标物加以隔离和保护。

2.3.2 羟自由基清除能力 由图5可知，随着酶解液质量浓度的增加，其羟自由基清除能力逐渐增强，由(61.29±0.21)%升高至(82.30±0.27)%，升高了34.28%(P<0.05)。酶解液与对照组的IC50分别为0.45，0.97 mg/mL，表明经酶解后溶液的羟自由基清除力显著上升。试验结果与甄润英等[14]报道的鲶鱼骨酶解物的抗氧化活性研究中羟自由基清除效果一致。

2.3.3 超氧阴离子自由基清除能力 由图6可知，羊骨酶解液与对照组的超氧阴离子自由基清除力存在显著差异(P<0.05)。酶解液的IC50为0.35 mg/mL，对超氧阴离子自由基的清除属浓度依赖型。羊骨粉溶解液(对照)的IC50为0.86 mg/mL，对超氧阴离子清除率随溶液质量浓度上升变化不明显(P>0.05)。这是由于歧化反应和一些其他的反应可以产生过氧化氢和羟自由基[15-16]，使清除力增强，且碱性蛋白酶能够显著提高羊骨酶解水解度，使羊骨粉水解彻底，因而小分子量肽段产量增加，酶解液的抗氧化性增强[17]。

表3 二次回归方程模型的方差分析†

2.3.4 还原力 由图7可知，酶解液还原力随着酶解液质量浓度的增加而增大。酶解组相比对照组，其还原力显著提升，酶解液与对照组的IC50分别为2.27，1.78 mg/mL，但峰值(OD值)分别为0.689 和0.091。还原力在初始浓度下，由0.022±0.001提高至0.247±0.002(P<0.05)，在最高浓度下，由0.077±0.001提高至0.484±0.007(P<0.05)。说明酶解可以有效提升酶解液的还原力，主要与其中形成的还原性氨基酸残基相关[13]。试验结果与刘倩霞等[18]报道的酶解曲拉干酪素研究中还原力效果一致。

图2 各因素的交互作用对水解度影响的响应面图

图3 各因素的交互作用对水解度影响的等高图

字母不同表示差异显著(P<0.05)

字母不同表示差异显著(P<0.05)

字母不同表示差异显著(P<0.05)

字母不同表示差异显著(P<0.05)

3 结论

采用响应面法对碱性蛋白酶酶解羊骨粉的工艺进行优化，并且对其酶解液的抗氧化活性进行了探究。结果表明，在酶解时间5 h，酶解温度为45 ℃，加酶量8 200 U/g，酶解pH值10的工艺条件可以较彻底地酶解羊骨粉，提高多肽得率。经酶解后的羊骨碱性蛋白酶解液具有良好的抗氧化性，其DPPH自由基清除率、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除率以及还原力相对未被酶解的羊骨粉溶解液均显著上升。

试验仅研究了酶解工艺优化及酶解液的抗氧化性，后续将在此基础上分离、纯化和鉴定分子质量不相同的肽段，并探求其序列，探究肽段的结构及其内在抗氧化机制。