河蚬抗氧化肽—锌螯合物的制备及结构表征

刘晶晶 徐蕴桃 朱晨慧 黄倩倩 韩曜平 王雪锋 张 然 戴阳军

(常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500)

河蚬(Corbiculafluminea)，一种常见的软体动物，别名黄蚬、沙蜊等，原产于亚洲，主要栖居于淡水(或咸淡水)河、湖和入海口处。河蚬营养价值高，干样粗蛋白高达60%左右，粗脂肪约为10.91%[1]，其中糖蛋白、金属硫蛋白等具有预防肿瘤、氧化和调节免疫等功能；含有17种氨基酸，其中必需氨基酸占总氨基酸的39%；此外，还富含EPA、DHA及大量活性多糖物质，能有效对抗心血管疾病、增强机体免疫[2]，为保健类产品的优质原材料，其药用和食疗价值引起了越来越多国内外学者的关注。

锌作为一种人体必不可少的微量元素，与动物的感官功能和记忆有关，全球约25%的人存在缺锌问题[3-4]。研究[5]表明，多肽—锌螯合物可经肽消化吸收通路将锌元素输往血液，更利于机体利用，可弥补传统锌制剂利用率低和生物毒性高的不足，与氨基酸锌相比，其吸收更快，能耗更少。

近年来，有关抗氧化肽金属螯合物方面的研究多集中于螯合工艺条件优化及抗氧化性测定，关于螯合产物结构的研究相对较少，相关的研究[6-7]缺少对螯合原料多肽的纯化，无法确保螯合原料的纯度，对螯合产物的结构分析也不够全面。试验拟以河蚬为原料，制备抗氧化肽—锌螯合物，采用多种光谱分析河蚬抗氧化肽螯合锌的结构性质，为抗氧化肽金属螯合物的构效关系及实际应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

速冻河蚬肉：江苏省宿迁楠景水产品有限公司；

中性蛋白酶：分析纯，上海蓝季生物有限公司；

葡聚糖凝胶G-50：上海蓝季科技发展有限公司；

双硫腙、三氯乙酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

七水合硫酸锌、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、水合茚三酮：分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；

三氯化铁、硫化钠、铁氰化钾：分析纯，天津致远化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

分析天平：EL104型，梅特勒—托利多仪器制造有限公司；

数显恒温水浴锅：HH-2型，金坛市杰瑞尔电器有限公司；

高速组织捣碎机：上海市比朗仪器制造有限公司；

超低温冰箱：BCD-216TDXZA型，青岛市海尔电器股份有限公司；

台式冷冻干燥机：Alpha 1-2 LDplus型，博劢行仪器有限公司；

高速台式冷冻离心机：TGL-16M型，长沙市湘仪有限责任公司；

数字pH计：pHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

集热式恒温磁力搅拌器：DF-101B型，金坛市医疗仪器厂；

自动部分收集器：BSZ-30型，上海沪西分析仪器厂；

紫外分光光度计：UV-754型，上海市精密科学仪器制造有限责任公司；

紫外—可见分光光度计：Cary300型，美国安捷伦公司；

傅立叶红外光谱仪：Nicolet iS10型，美国赛默飞世尔科技公司；

荧光分光光度计：F-7000型，日本日立公司；

X射线衍射仪：D/max-2200/pc型，日本理学公司；

热场发射电镜扫描仪：ZEISS ΣIGMA型，德国卡尔蔡司。

1.2 试验方法

1.2.1 河蚬抗氧化肽的制备

(1) 河蚬肉酶解液粉末的制备：将速冻河蚬肉解冻清洗，挤干称重，加入2倍质量的蒸馏水，捣碎搅匀。按河蚬肉质量的3.76%添加中性蛋白酶，55.36 ℃酶解4 h[8]，100 ℃水浴灭酶20 min，冷却后，4 000 r/min离心30 min，取上层清液，冷冻干燥，粉碎，冷藏待用。

(2) 河蚬抗氧化肽的分离纯化：根据文献[9]的方法稍作修改。取适量河蚬肉酶解液粉末，配成浓度为50 mg/mL样液，4 000 r/min离心30 min，采用葡聚糖凝胶G-50对上清液进行分离。上样量2 mL，蒸馏水作洗脱液，由自动收集器每5 min收集一管，样品流速0.5 mL/min，共集400管，测定收集液的吸光度值。根据吸光度值合并相同分离峰的洗脱液，干燥成粉末，冷藏待测。

(3) 各组分总抗氧化性的测定：称取分离后各个分离峰的酶解液粉末，分别配成50 mg/mL的溶液。量取1 mL各样液于试管中，分别加入0.2 mol/L(pH=6.6)PBS溶液和1%的K3[Fe(CN)6]溶液各1 mL，于50 ℃水浴20 min，添加质量分数10%的三氯乙酸溶液1 mL，1 000 r/min 离心4 min。取上清液1 mL，分别加入蒸馏水1 mL和0.1%的三氯化铁溶液0.2 mL，振动摇匀，50 ℃ 水浴10 min，溶液渐渐由黄变蓝[10-11]，于700 nm处测定其吸光值。蒸馏水代替样品作空白组。

1.2.2 河蚬抗氧化肽—锌螯合物的制备 称取一定量的抗氧化肽冻干粉末，配成20 mg/mL的溶液，充分搅匀，按肽锌质量比2.18∶1加入一定量的硫酸锌溶液，调节pH至5.07，52.65 ℃下反应46.50 min[12]，冷却，4 000 r/min 离心20 min，取沉淀，用80%乙醇进行洗涤再离心，反复数次，上清液中分别加入双硫腙和水合茚三酮(检测溶液中的游离锌离子和抗氧化肽)直至不变色。沉淀冷冻干燥备用。

1.2.3 河蚬抗氧化肽-锌螯合物的定性检测 根据文献[13]略作修改。称取少量反应产物冻干粉，蒸馏水溶解，滴入5滴茚三酮指示剂，加热煮沸3 min，观察是否发生颜色变化。取适量反应产物冻干粉配成溶液，添加过量的硫化钠粉末，放置5 min，若有沉淀生成，5 000 r/min离心5 min，取上清液，滴5滴水合茚三酮指示剂，沸腾3 min，观察是否出现颜色变化。

1.2.4 河蚬抗氧化肽—锌螯合物的结构表征 根据文献[6，14]的方法并稍作修改。

(1) 紫外—可见光光谱分析：将制备好的抗氧化肽—锌螯合物配制成0.1 mg/mL溶液，8 000 r/min离心15 min，取上清液放入扫描室，设置波长190～400 nm进行扫描分析。并在相同条件下对参加反应的抗氧化肽进行处理，作为对照组。

(2) 红外光谱分析：称取螯合物粉末2 mg，加入适量的色谱级KBr，研磨，烘干。取少量研磨后的粉末进行压片并置于样品槽中，4 000～500 cm-1内扫描。并在相同条件下对参与螯合反应的抗氧化肽进行处理，作为对照组。

(3) 荧光光谱分析：分别称取适量的抗氧化肽与抗氧化肽—锌螯合物，配制成1 mg/mL的溶液，8 000 r/min离心20 min，取上清液用于检测。蒸馏水作对照，设激发波长280 nm，室温条件下测定两种样品在320～520 nm处的发射光谱。

(4) X射线衍射分析：取适量抗氧化肽—锌螯合物研磨至直径<10 μm，填入样品槽中，铺压成平整试片，设置仪器参数为加速电压40 kV，扫描范围(2θ)5°～90°，扫描速度4°/min。并在相同条件下对参与螯合反应的抗氧化肽粉末进行预处理并扫描。

(5) 扫描电镜分析：用牙签挑取少量抗氧化肽和抗氧化肽—锌螯合物粉末，均匀涂至贴有黑色双面胶的载样板上，再于喷金装置内喷金。将预处理好的样品进行扫描，扫描电镜工作电压5 kV，3 000×获得图像。

1.3 数据处理

采用Excel记录和汇总试验数据，采用Excel和Origin 7.0软件进行制图分析。

2 结果与分析

2.1 河蚬抗氧化肽的分离纯化

2.1.1 葡聚糖凝胶G-50分离河蚬肉酶解液 由图1可知，河蚬肉酶解液经分离后共得到5个清晰的洗脱峰，按洗脱液出峰的顺序分别将其命名为F1、F2、F3、F4、F5。

2.1.2 河蚬肉酶解液中抗氧化肽的总抗氧化性 由图2可知，5个组分均具有抗氧化活性，组分F2、F3的总抗氧化性能高于其他3个组分的，700 nm处的吸光值分别为2.03，1.79。鲍鱼下脚料抗氧化肽最高抗氧化活性A700 nm为(0.598±0.050)[15]，蟹抗氧化肽最高抗氧化活性A700 nm为0.841[16]，说明河蚬肉酶解液抗氧化肽具有较高的研究价值。

图1 河蚬肉酶解液的Sephadex G-50 洗脱曲线

2.2 抗氧化肽—锌螯合物的定性分析

研究[17]表明，金属硫化物在一般情况下的稳定常数大于抗氧化肽金属螯合物的，当加入硫化钠时，常温下就可将抗氧化肽—锌螯合物中的锌离子置换，生成更稳定的硫化锌沉淀，原反应物中的抗氧化肽变成游离态。通过试验可知，抗氧化肽与锌的反应产物经水合茚三酮指示剂在煮沸情况下检测后未变色，无多余的游离抗氧化肽原料，说明螯合产物有一定的纯度。当添加过量的硫化钠粉末后，产生了沉淀，离心后上清液中滴加茚三酮试剂发生变色，表明上清液存在游离抗氧化肽，说明抗氧化肽与锌发生了螯合反应。综上，抗氧化肽与锌发生螯合且螯合反应得到了有一定纯度的螯合物粉末。

2.3 抗氧化肽—锌螯合物的结构表征

2.3.1 紫外光谱分析 由图3可知，抗氧化肽溶液最大吸光度对应的波长为194.02 nm，属于抗氧化肽羰基和肽键的特征吸收峰。加入锌螯合后，抗氧化肽—锌螯合物吸收峰发生了变化，最大吸收峰接近190 nm，与螯合前的差距>4 nm，可能是锌离子与抗氧化肽螯合后改变了原有的基团结构，基团原子的价电子发生跃迁，最大吸光度对应的波长产生移动[18]，说明抗氧化肽与锌发生了螯合。

图3 抗氧化肽—锌螯合物与抗氧化肽的紫外光谱

图4 抗氧化肽—锌螯合物与抗氧化肽的红外光谱

2.3.3 荧光光谱分析 由图5可知，河蚬抗氧化肽与锌螯合前后的荧光强度存在显著差异(P<0.05)，螯合后的抗氧化肽分子中的荧光生色基团发生了结构上的变化，抗氧化肽中加入锌离子后图谱由1个强峰变为1个弱峰，说明锌离子与抗氧化肽发生了螯合反应，改变了原有结构。

2.3.4 X射线衍射光谱分析 由图6可知，抗氧化肽与抗氧化肽螯合锌的衍射强度峰存在显著差异(P<0.05)表明抗氧化肽在螯合锌离子后，自身结构发生了一定改变。

图5 抗氧化肽—锌螯合物与抗氧化肽的荧光光谱

图6 抗氧化肽—锌螯合物与抗氧化肽的X射线衍射光谱

2.3.5 电镜扫描结构分析 由图7可知，抗氧化肽表面更光滑且存在空洞，可能是抗氧化肽经冷冻干燥后留下的亲水区痕迹；抗氧化肽—锌螯合物表面更粗糙，存在许多颗粒结构物质(锌晶体)[20]，这些颗粒经电镜扫描电击后仍牢牢覆盖于肽表面，使原本光滑的肽面凹凸不平，说明锌与肽发生了相互作用且结合紧密，结构也变得更加复杂。

图7 扫描电镜图

3 结论

由于制备的抗氧化肽—锌螯合物结构较为复杂，其具体结构及一些生物活性机理有待进一步探究，锌离子与各基团连接键的类型也有待进一步研究。