流动注射分光光度法测定鱼肉及其制品中挥发酚残留量

程银棋郑 欣柳 迪冯 灏朱 影彭青枝周陶鸿

(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430075；2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075；3. 武汉市华测检测技术有限公司，湖北 武汉 430223)

酚类化合物是一种芳香族羟基化合物。根据沸点差异，通常分为挥发酚(<230 ℃)和不挥发酚(≥230 ℃)。挥发酚是水产品常规监测项目，参考中国水产研究院[1]建议鱼中挥发酚残留量标准≤0.2 mg/kg。据文献[2]记载有生活在中下层水中的鱼(如：青鱼、鲤鱼等)挥发酚残留量很高。水产品中过量的酚能影响水产品血液中的各项酶活性，酚能通过改变链接蛋白位置来对人体肠道上皮细胞的功能产生阻碍作用[3]，酚还能抑制肠道乳酸菌的活性[4]。此外，还有酚类化合物对人及哺乳动物有促癌作用的报道[5]。目前，中国已有测定鱼肉中挥发酚含量的标准方法(GB 5009.231—2016《食品安全国家标准 水产品中挥发酚残留量测定》)，但无论是在蒸馏还是萃取、比色过程中都存在诸多影响挥发酚检测准确性的因素。

连续流动分析仪是近年来迅速发展起来自动化程度高，环境污染小、人为误差低的自动生化分析仪[6]。其原理是样品或标准溶液通过一个采样器被蠕动泵吸出流过整个系统，同时反应所需要的试剂也通过泵自动加入，与样品或标准溶液混合反应，并在最后流经检测器时完成对目标物的检测和信号记录以及分析过程。根据检测方式的不同分为流动注射分光光度法、流动注射原子光谱法、流动注射电化学分析法、流动注射荧光及化学发光法等[7-10]。该方法消耗的试剂量以及样品的取样量(以微升为计量单位)较挥发酚含量标准检测方法(GB 5009.231—2016)用量少，节约成本，废液少，环境污染小[11-12]。

研究拟采用连续流动分析仪建立鱼肉及其制品中挥发酚残留量快速检测的流动注射分光光度法，并与GB 5009.231—2016《食品安全国家标准 水产品中挥发酚残留量测定》法进行方法学上比较，以期为检测机构及生产企业提供检测技术指导及应用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 材料

鲜鱼及鱼制品：湖北省食品质量安全监督检验研究院日常监督抽检及风险监测的抽检样品。

1.1.2 仪器

电子分析天平：ME204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

全自动连续流动分析仪：San++型，荷兰SKalar公司；

超声波双频清洗机：SB25-12DTS型，宁波新芝生物科技有限公司；

均质器：B-400型，瑞士Buchi实验室仪器公司；

超纯水器：PURELAB Chorus l型，英国ELGA公司。

1.1.3 试剂

氯化铵、氨水、NaOH、铁氰化钾、硫酸、硫酸铜：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

4-氨基安替比林：德国Sigma公司；

苯酚标准储备溶液：浓度为1 000 mg/L，北京坛墨质检科技有限公司；

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

(1) 标准中间液：吸取1 mL 1 000 mg/L苯酚标准溶液于100 mL容量瓶中，用0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，混匀，即为10.00 mg/L苯酚标准中间液。

(2) 标准使用液：吸取10 mL 10.00 mg/L苯酚标准中间液于100 mL容量瓶中，0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，混匀，待用，即为1.00 μg/mL酚标准使用液。

(3) 标准系列工作液：分别吸取1.00 μg/mL酚标准使用液0.00，0.20，0.50，1.00，1.50，2.00，4.00 mL 置于100 mL 容量瓶中，用0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，混匀，待用，即为0.00～40.00 μg/L标准系列液浓度，临用配制。

1.2.2 样品前处理 鲜鱼去鳞、内脏、骨及刺，清洗后粉碎机粉碎，均质器匀浆后装于密封袋，于-20 ℃封口保存，待测。鱼肉制品直接粉碎均匀，待测。前处理方法参照文献[13]稍作改变：称取粉碎后的样品4 g (精确至0.001 g)于100 mL容量瓶中，加入75 mL 100 g/L NaOH溶液，超声10 min，滴入3滴甲基橙指示剂，然后加入9.2 mol/L硫酸至溶液呈橙红色，加入100 g/L 硫酸铜溶液5 mL，加蒸馏水定容至刻度，混匀，过滤，收集滤液，过0.45 μm微孔水系滤膜，待上机。

1.2.3 样品测定方法 接通电源，依次打开软件工作站、数据转换器、自动进样器等设备，迅速将取样器冲洗管及3条试剂管放入纯水中，清洗5 min，后将取样器冲洗管放入0.01 mol/L NaOH溶液中，3条试剂管分别放入对应试剂瓶(试剂瓶A：0.4 mg/mL 4-氨基安替比林；试剂瓶B：1 mg/mL 铁氰化钾；试剂瓶C：10%磷酸溶液)中，运行10 min，将装满标准系列工作液及样品待测液的进样小杯置于样品盘正确位置，后标准系列工作液与样品待测液通过采样器被蠕动泵吸出流出整个系统，并吸入空气将流体不断地输送，样品待测液与标准系列工作液与试剂C混合后在线水蒸气蒸馏(加热器温度135 ℃)，后馏出液流出，依次与试剂A、试剂B混合，混合液在混合圈中充分混合并反应，再经检测器检测，在500 nm滤光片下测定。

全自动连续流动分析仪控制参数：波长500 nm，进样针清洗时间60 s，到达阀时间63 s，加热器温度145 ℃，注射时间97 s，进样时间60 s，冲洗时间100 s。

1.2.4 样品挥发酚残留量计算 以浓度为横坐标，响应值峰高为纵坐标，绘制标准曲线。用与绘制标准曲线相同的仪器条件，测定空白与样品待测液的强度，按照线性方程求出相应质量浓度，再按式(1)计算样品中挥发酚残留量。样品均称取4.000 g，提取后定容至100 mL容量瓶中。

(1)

式中：

A0——空白溶液峰高响应值，cm；

A——样品待测液测得的峰高响应值，cm；

v——样品定容体积，mL；

a——标准曲线截距；

k——标准曲线斜率；

m——鱼肉样品质量，g；

X——样品中挥发酚残留量(以苯酚计)的含量，mg/kg。

1.2.5 数据统计分析 采用SPSS 12.0软件。

2 结果与讨论

2.1 方法线性及检出限

试验方法在0.00～40.00 μg/L范围内线性方程为Y=1.002X-0.152，相关系数R2=0.999 9，标准曲线峰形图如图1所示。表明连续流动化学分析仪测定挥发酚(以苯酚计)质量浓度在0.00～40.00 μg/L范围内线性良好，可以满足鱼肉及其制品中挥发酚残留量的检测需求。

按照1.2试验步骤进行11次空白试验，经计算得批内标准偏差Sd为0.398，以3Sd所对应样品中挥发酚(以苯酚计)含量为检出限。计算得出挥发酚(以苯酚计)检出限为0.030 mg/kg，低于GB 5009.231—2016《食品安全国家标准 水产品中挥发酚残留量测定》标准规定的检出限0.05 mg/kg要求，说明流动注射分光光度法检出限低、方法可靠。

图1 标准曲线峰形图

2.2 精密度及回收率

分别取代表性海水鱼(带鱼、大黄鱼)、淡水鱼(草鱼、鲫鱼)、鱼肉制品(鱼丸、鱼糕)4 g，按照1.2步骤进行样品前处理及测定，6次重复试验测得精密度结果见表1。由表1可知：连续流动分析仪测定6种鱼肉及其制品中的挥发酚残留量精密度为0.952%～6.543%，低于GB 5009.231—2016《食品安全国家标准 水产品中挥发酚残留量测定》规定的≤10%的精密度要求。

分别取代表性海水鱼(带鱼、大黄鱼)、淡水鱼(草鱼、鲫鱼)、鱼肉制品(鱼丸、鱼糕)4 g，按照1.2步骤的样品前处理及方法测定要求，进行低、中、高3水平(0.05，0.10，0.50 mg/kg)加标回收率试验。由表2可知，连续流动分析仪测定6种鱼肉及其制品中的挥发酚残留(以苯酚计)加标回收率为72.000%～90.827%，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中规定的检测方法确认的回收率技术指标的要求，说明该方法测定鱼肉及其制品中的挥发酚残留(以苯酚计)加标回收率较好。

表1 精密度测定

表2 回收率测定

2.3 方法验证

2.3.1 检测结果比对 采用GB 5009.231—2016《食品安全国家标准 水产品中挥发酚残留量测定》与试验方法对含一定含量的挥发酚(以苯酚计)样品测定，检测结果如表3所示，试验方法测定6种样品的峰形图如图2所示。由表3可知，试验方法与标准方法重现性较好，仪器比对差异为2.0%～8.4%。另外，淡水鱼挥发酚残留量比海水鱼低，可能是海水被石油等污染导致挥发酚残留量较高，海水鱼较淡水鱼生活在更下层，污染较为严重，挥发酚残留量浓度较高，与文献[14-16]报道一致。

2.3.2 测试效率比对 从检测样品数、试剂用量、废液产生量及测试时间四方面进行比较，结果如表4所示。由表4可知，试验方法比标准方法试剂用量节省93%以上、样品测定用时节省65%、测试效率提升3倍。由于试验方法所用样品待测液不足1.5 mL，大大减少了分析过程中与显色剂等试剂污染，废液产生量减少56.5%。此外，试验方法考虑了水蒸汽蒸馏过程的挥发酚残留量损失情况，标准系列工作液于同样仪器条件下，经过蒸馏提取，得到的线性方程使得样品待测液中挥发酚残留量浓度更准确，这一点较标准方法更精确。

图2 样品峰形图

表3 连续流动分析法与标准方法比对

表4 测试效率比较

3 结论

试验选择有代表性的淡水鱼、海水鱼及其鱼肉制品为研究对象，通过在线水蒸汽蒸馏提取，探究了流动注射分光光度法测定挥发酚残留量(以苯酚计)，在仪器优化条件下，挥发酚残留量(以苯酚计)浓度在0.00～40.00 μg/L 的范围内遵循比尔定律，有良好的线性关系，相关系数为0.999 9，方法检出限、精密度均低于GB 5009.231—2016《食品安全国家标准 水产品中挥发酚残留量测定》规定的检出限0.05 mg/kg、精密度≤10%的要求；加标回收率符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中规定的检测方法确认的指标要求；流动注射分光光度法比标准方法试剂用量节省93%以上，样品测定用时节省65%，废液产生量减少56.5%，测试效率提升3倍。试验证明，建立的方法具有检出限低、高效、环保及大批量样品检验的优势，适用于检测机构及生产企业推广应用。