产氢抗氧化丁酸梭菌高效发酵工艺参数的优化

■杜孟思 王晓冰 姚蒙蒙 斯大勇

（中国农业大学饲料生物技术实验室动物营养学国家重点实验室，北京100193）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），作为2009 年我国批准的新一代微生物饲料添加剂，由于其严格厌氧和难以培养的特点，在实际生产中面临着生物量低、成本高等问题，还未实现产业化批量生产[1]。但是，与其他非芽孢类益生菌相比，丁酸梭菌因其内生孢子，具有更好的抗逆性。在体外经90 ℃处理20 min后仍不失活；在体内能耐胃酸和胆盐，且只对极少数抗生素敏感。同时丁酸梭菌还能产生丁酸、氢气以及多种酶等对畜禽有益的物质，其中，丁酸是代谢过程中的主要产物之一，是结肠上皮细胞的主要能量来源，可为肠黏膜细胞提供70%以上的能量，它在肠黏膜修复和维持肠道结构完整性中起重要作用[2-4]。因此丁酸梭菌在实际生产中具有较高的应用价值。本实验室前期从不同动物肠道和粪便中分离筛选出16株丁酸梭菌，以SCFA产量为指标，从中挑选出5株产酸能力较强的菌株进行生化鉴定和特异性分子鉴定；然后以活菌数、芽孢存活率以及淀粉酶和纤维素酶活力等指标进行复筛，最后挑选出一株生物学性能和抗逆性优异的丁酸梭菌CGMCC No.8187。研究发现该菌株可以产生丁酸、SOD、NADH氧化酶以及H2和CO2等气体，其中H2产量高达37.49 ml/50 ml发酵液，24 h产丁酸18 mM[5]。为了进一步实现产氢抗氧化丁酸梭菌高效发酵，本试验旨在通过单因素试验和正交试验，优化发酵培养基的组成，来提高丁酸梭菌的生物量，为丁酸梭菌的工业发酵工艺和实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌种

丁酸梭菌CGMCC No.8187（Clostridium butyricumCGMCC No.8187）由本实验室前期自行筛选获得，并授权发明专利ZL201410469885X。

1.2 主要仪器

智能型生化培养箱(广东省医疗器械厂)、电热鼓风干燥箱(北京博宇宝威试验设备有限公司)、pH 计(METTLER TOLEDO)、立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备有限公司)、数显恒温搅拌循环水箱(常州国华电器有限公司)、生物显微镜(重庆澳浦光电技术有限公司)。

1.3 培养基的配制

强化梭菌培养基（Reinforced Clostridium Medium,RCM）：10 g/l 牛肉膏、5 g/l 葡萄糖、10 g/l 胰蛋白胨、3 g/l 酵母浸粉、5 g/l 氯化钠、1 g/l 可溶性淀粉、0.5 g/l半胱氨酸盐酸盐、3 g/l 乙酸钠，调节pH 值至（7.1±0.1），121 ℃灭菌20 min。

初始发酵培养基：10 g/l酵母浸粉、20 g/l葡萄糖、1 g/l硫酸铵、5 g/l 氯化钠、4 g/l磷酸氢二钾、5 g/l增效剂、2 g/l碳酸钙，调节pH值至（7.1±0.1），121 ℃灭菌20 min。

1.4 丁酸梭菌的培养及计数方法

种子活化及培养方法：取储存在-80 ℃冰箱中的甘油管菌株500 μl 接种到含有9 ml 的强化梭菌培养基的试管中，在培养基表面覆盖高约2 cm 的1∶1 混合配制的石蜡凡士林以进行油封，并在37 ℃恒温培养箱中静止培养48 h。随后，再吸取1 ml接种到新鲜灭菌的强化梭菌培养基中，37 ℃培养至对数期即可作为种子液进行后续试验。丁酸梭菌的发酵培养采用液体深层静止培养，100 ml 三角瓶装液量100 ml，用石蜡凡士林对三角瓶进行油封，于37 ℃恒温培养箱中静止培养24 h后计数。

计数方法采用血球计数板法[6]。

1.5 单因素试验

1.5.1 有机氮源的筛选

选取胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、大豆蛋白胨、大豆粕和肽粉进行有机氮源筛选试验，起始添加量均为1%，初始培养基中其他成分固定不变。37 ℃培养24 h 后，取样测定菌体浓度，探究不同有机氮源对丁酸梭菌菌体浓度的影响。

1.5.2 有机氮源添加量的筛选

在确定最佳有机氮源后，进一步筛选有机氮源的最优添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%）。

1.5.3 无机氮源的筛选

有机氮源成分确定后，在硫酸铵、氯化铵、尿素和柠檬酸铵中筛选最佳的无机氮源种类。以初始发酵培养基中1 g/l的硫酸铵含氮量为基准，固定其余无机氮源的含氮量一致，起始添加量均为含氮量0.2 g/l，初始培养基中其他成分固定不变。37 ℃培养24 h后，取样测定菌体浓度，探究不同无机氮源对丁酸梭菌菌体浓度的影响。

1.5.4 无机氮源添加量的筛选

在确定最佳无机氮源后，进一步筛选无机氮源的最优添加量（0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%）。

1.5.5 碳源的筛选

分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米纤维和麸皮5 种碳源来替换原培养基中1%的葡萄糖，剩余的1%葡萄糖添加量以及培养基其他成分均保持不变。37 ℃培养24 h后，取样测定菌体浓度，探究不同碳源对丁酸梭菌菌体浓度的影响。

1.5.6 碳源添加量的筛选

确定最佳碳源后，进一步筛选出碳源的最优添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)。

1.5.7 除氧剂的筛选

丁酸梭菌属于严格厌氧菌，在培养基中加入合适的除氧剂能够达到降低培养液中溶解氧浓度的目的，从而更有利于菌体的生长。因此本试验选择了半胱氨酸盐酸盐、抗坏血酸和还原铁粉作为除氧剂，起始添加量均为1%，初始培养基中其他成分固定不变。37 ℃培养24 h后，取样测定菌体浓度，探究不同除氧剂对丁酸梭菌菌体浓度的影响。

1.5.8 除氧剂添加量的筛选

确定最佳除氧剂后，进一步筛选除氧剂的最优添加量（0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%）。

1.5.9 磷酸氢二钾最佳浓度的筛选

影响丁酸梭菌生长的其中一个重要原因是酸胁迫效应。丁酸梭菌生长过程中会产生丁酸和乙酸，而培养液中有机酸的不断积累会毒害细胞并影响菌体生长，而磷酸氢二钾作为磷源缓冲剂，当微生物分泌酸性物质时，它与磷酸氢二钾反应生成磷酸二氢钾。因此进行磷酸氢二钾的最佳添加量的筛选（0.20%、0.30%、0.40%、0.50%和0.60%）。

1.6 正交试验

根据前面单因素筛选试验得出的结果，选择影响丁酸梭菌菌体生长最显著的三个因素进行正交试验，综合其最佳浓度设计L9(34)正交试验，每个组合进行三次重复试验，以确定在上述3个因素的作用下适合丁酸梭菌生长的最优组合方案。

1.7 结果分析和统计方法

运用SPSS 22.0 统计软件对数据进行分析，统计数据可视化采用Excel软件。

2 结果

2.1 单因素试验

2.1.1 有机氮源的筛选

不同有机氮源种类筛选结果如图1所示。由图1可知，大豆蛋白胨为最佳的有机氮源，能促进丁酸梭菌的生长，菌体浓度高于酵母浸粉（P＞0.05），并显著高于其他有机氮源（P＜0.05），达到1.62×108个/ml。

图1 不同有机氮源对丁酸梭菌菌体浓度的影响

2.1.2 有机氮源添加量的筛选

在以大豆蛋白胨为最佳有机氮源的基础上，优化其添加量，其结果如图2所示。由图2可知，大豆蛋白胨添加量为0.5%时菌体浓度最高，为1.5×108个/ml，与1%添加量没有显著差异（P＞0.05），但极显著高于其他添加水平组（P＜0.01）。

图2 大豆蛋白胨浓度对丁酸梭菌菌体生长的影响

考虑到复合有机氮源可能比单独添加一种有机氮源更有利于丁酸梭菌菌体生长，因此随后选择了效果最好的两种有机氮源（大豆蛋白胨和酵母浸粉）进行复合氮源试验。保持0.5%的总添加量不变，大豆蛋白胨∶酵母浸粉分别为3∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶3。其结果如图3所示。当大豆蛋白胨∶酵母浸粉为1∶2时，菌体浓度达到2.3×108个/ml，极显著高于其他组（P＜0.01），比单独添加大豆蛋白胨时菌量提高了40%左右。综合上述试验结果，最终选定大豆蛋白胨和酵母浸粉作为复合有机氮源添加，添加总量为0.5%，比例为1∶2。

图3 复合有机氮源对丁酸梭菌菌体浓度的影响

2.1.3 无机氮源的筛选

由于微生物对有机氮源利用速率不如无机氮源，为保证菌体早期生长，需要对无机氮源种类以及添加量进行筛选，无机氮源筛选结果如图4所示。柠檬酸铵是最适合丁酸梭菌菌体生长的无机氮源，菌体浓度达到1.91×108个/ml，显著高于(除硫酸铵外)其他处理组(P＜0.05)。

2.1.4 无机氮源添加量的筛选

对无机氮源添加量进行筛选，由图5 可以看出，当柠檬酸铵浓度提高到一定范围后，菌体浓度并没有随着其提高而继续增加，0.30%添加量组与0.40%添加组没有显著差异（P＞0.05），因此将柠檬酸铵的添加量定为0.3%，菌体浓度达到2.14×108个/ml，极显著高于其他三个添加水平（P＜0.01）。

图4 不同无机氮源对丁酸梭菌菌体浓度的影响

图5 柠檬酸铵浓度对丁酸梭菌菌体浓度的影响

2.1.5 碳源的筛选

不同碳源种类筛选结果如图6所示。由图6可知，当葡萄糖作为碳源时，丁酸梭菌菌体生长最佳，菌体浓度达到2.9×108个/ml，显著高于其他处理组（P＜0.05）。

2.1.6 碳源添加量的筛选

确定最佳碳源种类后对添加量进行筛选，其结果如图7 所示。葡萄糖添加量为2%时菌体浓度最高，达到2.91× 108个/ml，与2.5%添加组没有显著差异（P＞0.05），与其他处理组差异极显著（P＜0.01）。

2.1.7 除氧剂的筛选

除氧剂筛选结果如图8 所示，与空白对照组相比，添加不同除氧剂后提高了丁酸梭菌的菌体浓度，其中抗坏血酸的除氧效果最佳，菌体浓度达4.3×108个/ml，极显著高于其他处理组（P＜0.01）。

图6 不同碳源对丁酸梭菌菌体浓度的影响

图7 葡萄糖浓度对丁酸梭菌菌体浓度的影响

图8 除氧剂对丁酸梭菌菌体浓度的影响

2.1.8 除氧剂添加量的筛选

结果如图9所示，0.05%的添加量最适合丁酸梭菌的生长，菌体浓度达4.9×108个/ml，菌体浓度随着抗坏血酸浓度的增加呈现不同程度的下降。因此，综合上述试验结果，最终选择抗坏血酸作为除氧剂且添加量为0.05%。

图9 抗坏血酸浓度对丁酸梭菌菌体浓度的影响

2.1.9 磷酸氢二钾最佳浓度的筛选

磷酸氢二钾最佳浓度的筛选结果如图10 所示，由图10可以看出，磷酸氢二钾的添加量为0.3%时，菌体浓度最高，达4.73×108个/ml，显著高于其他处理组（P＜0.05）。

图10 磷酸氢二钾浓度对丁酸梭菌菌体浓度的影响

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，选取葡萄糖（A）、复合有机氮源（B）以及磷酸氢二钾（C）三个对菌体浓度的影响较大的三个因素，综合其最佳浓度设计L9(34)正交试验，每个组合进行三次重复试验，以确定在上述三个因素的作用下适合丁酸梭菌生长的最优组合方案。正交试验因素水平表见表1，正交试验设计与结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平

由表2 和表3 可知，综合极差分析和方差分析结果，各影响因素的主次顺序为：葡萄糖＞复合氮源＞磷酸氢二钾，且三个因素的水平均对试验结果有极显著影响（P＜0.01）。因此，根据试验结果确定最优组合方案为A2B1C3，即发酵培养基中葡萄糖浓度为2%，复合氮源（大豆蛋白胨∶酵母浸粉=1∶2）浓度为0.5%，磷酸氢二钾浓度为0.4%。

表2 正交试验设计方案与结果

表3 正交试验方差分析

2.3 最优组合验证试验

为了确定最佳培养基组合方案的稳定性，根据直观分析和方差分析得出的最优组合方案，进行进一步的验证试验。即培养基各组分分别为：1.67 g/l 大豆蛋白胨、3.33 g/l 酵母浸粉、20 g/l 葡萄糖、3 g/l 柠檬酸铵、5 g/l 氯化钠、4 g/l 磷酸氢二钾、5 g/l 增效剂、2 g/l碳酸钙、0.5 g/l 抗坏血酸，调初始pH 值为(7.1±0.1)，37 ℃培养24 h后测定菌体浓度。结果为在该条件下丁酸梭菌的菌体浓度达4.75×108个/ml，高于组合表中的最高值。综合单因素试验和正交试验结果，丁酸梭菌菌体浓度较优化前提高了3.3倍。

3 讨论

目前，专门用于培养丁酸梭菌的培养基很少见，且通过优化丁酸梭菌发酵培养基组分来提高生物量的研究较少，主要集中在提高其代谢产物丁酸、1,3-丙二醇或氢气的产量上，丁酸梭菌的生物量普遍不高。本实验室从动物肠道内容物以及新鲜粪便中分离出一株生物学特性和抗逆性优异的丁酸梭菌CGMCC No.8187。该菌株可以产生纤维素酶和淀粉酶，能水解纤维素和淀粉等碳水化合物生成低聚糖供有益菌利用；通过产生氢气、SOD 和NADH 氧化酶等来提高机体的抗氧化能力；同时耐高温、耐胃肠液[5]。丁酸梭菌与其他微生物一样，生长和代谢过程受其培养条件的影响。因此，通过优化丁酸梭菌的发酵培养基组分来提高其生物量，降低生产成本，为工业上大规模生产丁酸梭菌制剂提供有价值的参考。

本试验首先采用单因素试验对初始发酵培养基里的各组分进行优化，筛选出最适合丁酸梭菌生长的碳源、氮源和除氧剂的种类及浓度。对单一有机氮源种类进行筛选后发现，大豆蛋白胨是最适合丁酸梭菌生长的有机氮源，其次是酵母浸粉。这与邢宏观[7]的研究结果大致相同。进行后续优化发现，添加复合有机氮源的效果更好，并最终确定大豆蛋白胨∶酵母浸粉的添加比例为1∶2。接着又对培养基中无机氮源的种类和浓度进行了筛选，确定柠檬酸铵效果最佳，其最适添加浓度为0.3%。碳源优化结果发现葡萄糖是最适合丁酸梭菌生长的碳源，这与戚薇等[8]和耿正颖[9]的研究结果吻合，并进一步优化得出2%的添加量最适合丁酸梭菌生长，且随着浓度的增高菌体浓度呈下降的趋势。丁酸梭菌与大多数细菌一样，在发酵过程中也存在碳溢流代谢现象，即当培养基中的碳源丰富时，糖酵解途径产生的丙酮酸不完全进入三羧酸循环，而是产生例如乙酸和乳酸等代谢产物[10]。丁酸梭菌作为严格的厌氧微生物，主要通过发酵葡萄糖以糖酵解途径和代谢过程中产生的乙酸、丁酸等给细胞供能。但当培养基中碳源丰富发生碳溢流代谢时，不仅需要消耗ATP将产生的乙酸和丁酸分泌到胞外，同时也增加了其能量供给的压力，从而影响了菌体的生长和代谢，这就是丁酸梭菌的酸胁迫效应，大量有机酸的积累限制了丁酸梭菌的生长[11-12]。

除了酸胁迫效应，氧气是影响丁酸梭菌生长的另一个重要因素。丁酸梭菌对氧浓度极其敏感，Kawasaki 等[4]研究发现当培养基中有氧气存在时，丁酸梭菌就会停止生长，但当培养基中的氧气除尽时又会重新开始正常生长。因此，考虑到这个因素，本试验采取在培养基中加入还原性物质来达到除氧的目的，结果表明添加除氧剂后均有促进丁酸梭菌菌体生长的作用，其中抗坏血酸的效果最好，菌体量与不添加组相比提高了两倍。随后对抗坏血酸添加量进行筛选后发现，0.5 g/l 的添加量最适合菌体生长，且随着浓度的增加菌体浓度呈降低的趋势，可能是由于添加过多的抗坏血酸影响了培养基的pH 值，进而改变了菌体生长环境。

4 小结

在摇瓶阶段根据单因素筛选试验和正交试验对丁酸梭菌发酵培养基组分进行了优化，最终确定的最佳培养基组合方案为：1.67 g/l大豆蛋白胨、3.33 g/l酵母浸粉、20 g/l 葡萄糖、3 g/l 柠檬酸铵、5 g/l 氯化钠、4 g/l 磷酸氢二钾、5 g/l 增效剂、2 g/l 碳酸钙、0.5 g/l 抗坏血酸，调初始pH为（7.1±0.1），此条件下丁酸梭菌菌体浓度达4.75×108个/ml，较优化前提高了3.3倍。