原花青素对饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡肝脏健康指标的影响

■卢文麒 何英霞 梁 英 陈学豪* 翟少伟，2

（1.集美大学水产学院 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，福建厦门361021；2.福建省水产生物育种与健康养殖工程研究中心，福建厦门361021）

研究表明，饲料中高水平组胺会导致肉食性鱼体内产生过量的氧自由基并使其代谢失衡，降低肝脏抗氧化酶活性，造成肝脏氧化应激和正常肝细胞凋亡，导致生长受到抑制[1-7]。为了缓解鱼类养殖中的氧化应激，在饲料中添加植物多酚成为近年来鱼类抗应激添加剂领域的研究热点，特别是葡萄籽原花青素（GSPs）因其能够清除鱼体内多种自由基，维持肝细胞膜的正常通透性，减少肝脏转氨酶的释放，降低丙二醛水平，提高肝脏抗氧化能力，改善内脏器官健康而备受关注[8-9]。GSPs能增强饲料镉胁迫下吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝胰脏和珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus lanceolatus×Epinephelus fuscoguttatus♀）肝脏的抗氧化能力[10-12]，提高热应激下绿唇鲍抗氧化能力和存活率[13]。GSPs在缓解饲料组胺胁迫方面，仅有改善美洲鳗鲡（Anguilla rostrata）生长性能和肠道健康的报道[14]，对美洲鳗鲡肝脏健康是否具有保护作用未知。因此，本试验以美洲鳗鲡为试验动物，研究在饲料组胺胁迫下添加GSPs 对美洲鳗鲡血清转氨酶活性和肝脏抗氧化能力的影响，为GSPs 在鳗鲡饲料中的利用开发提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验动物美洲鳗鲡幼鱼由厦门市同安区北溪鳗鱼养殖场提供。选择健康、规格接近、平均体重为（10.84±0.16）g 的美洲鳗鲡幼鱼480 尾进行试验，随机分4 个处理组（每组4 个重复，每个重复30 尾），即对照组、HIS组、HIS+GSPs组Ⅰ、HIS+GSPs组Ⅱ，其中对照组投喂基础饲料，其他组投喂在基础饲料中分别添加300 mg/kg组胺、300 mg/kg组胺+300 mg/kg GSPs和300 mg/kg 组胺+600 mg/kg GSPs 的试验饲料，试验期为77 d。

1.2 试验饲料

基础饲料为福州海马饲料有限公司生产的幼鳗配合饲料，主要由白鱼粉、红鱼粉、淀粉、酵母粉、膨化大豆及复合预混料组成，营养水平为粗蛋白46.58%、粗灰分12.35%、粗脂肪6.70%、水分7.36%。配制4种试验饲料，按照试验设计分别将组胺、GSPs与基础饲料逐级混匀（组胺添加量为300 mg/kg，饲料实测水平为534 mg/kg），分装于自封袋中，-20 ℃冷冻保存。组胺（C5H9N3，有效含量为98.2%）由上海源叶生物技术有限公司提供，配制饲料前将颗粒状研磨至粉末状；葡萄籽原花青素（GSPs，有效含量为98%）为葡萄籽中提取纯化的粉末状产品，由南京泽朗医药科技有限公司提供。

1.3 饲养管理

试验于集美大学水产学院海水场开展，将480尾美洲鳗鲡置于两个无循环水圆形养殖桶（直径为1.10 m,高为0.80 m,注水量为800 L）暂养两周。暂养期间投喂基础饲料，按料水比为1∶1.1 混合，手工制成面团状定时投喂，投喂1 h 后清除粪便。定时监测水质状况，维持水温为24～28 ℃，pH 值为7.2～7.9，溶氧浓度为7.0～9.0 mg/l，氨氮＜0.10 mg/l，亚硝酸盐＜0.005 mg/l，日换水量为1/3～1/2。试验开始后，将健康、规格相近的美洲鳗鲡随机分到16 个具有循环水装置的圆形养殖桶（直径为0.60 m，高为1.40 m，注水量为320 L）中，投饵率为每桶中鱼总重的1.5%左右，每日投喂两次（6：00和18：00），每次投饵1 h后采用虹吸管收集各养殖桶底的残饵和清除粪便。每天观察美洲鳗鲡幼鱼的摄食与生长状况，记录日投喂量、死亡数量，水质与暂养期间一致。

1.4 样品采集

试验第11周结束后，停食24 h，从各养殖桶中随机取9尾美洲鳗鲡，放入无水乙醇配制成2 g/l丁香酚中短暂麻醉，尾静脉取血，静置于4 ℃冰箱内8 h，待凝固分层后，于4 ℃离心机下离心（3 000 r/min）10 min，取上层血清，-80 ℃冻存待测。美洲鳗鲡取血后，迅速将其解剖，分离出肝脏，称量肝脏，并用4 ℃无菌去离子水清洗表面的血渍，液氮保存12 h 后，转至-80 ℃冰箱保存。取肝脏样品于4 ℃下解冻，漂洗，滤纸拭干及称量，按质量（g）∶体积（ml）=1∶9的比例加入预冷生理盐水，采用玻璃匀浆机制成10%匀浆，在4 ℃条件下3 500 r/min 离心10 min,，取上清转移至离心管中，-80 ℃保存待测。

1.5 试验指标测定

血清中谷草转氨酶（GPT）和谷丙转氨酶（GOT）活性，肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛(MDA)水平的测定均严格按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书的步骤进行。

1.6 数据统计与分析

所有结果以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示，用SPSS 22.0分析软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan's 法对存在显著差异的数据进行多重比较，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 GSPs对饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡血清转氨酶活性的影响(见图1)

图1 GSPs对饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡血清转氨酶活性的影响

由图1 可知，与对照组相比，HIS 组血清GPT 和GOT 活性显著升高（P＜0.05）；HIS+GSPs 组与对照组和HIS 组接近（P＞0.05），HIS+GSPs 组间无显著差异（P＞0.05）。

2.2 GSPs对饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡肝脏抗氧化指标的影响(见图2)

由图2 可见，HIS 组美洲鳗鲡肝脏T-AOC 和CAT活性显著低于对照组（P＜0.05），GSH 和MDA 水平无显著变化（P＞0.05）；HIS+GSPs 组美洲鳗鲡肝脏TAOC、GSH水平和CAT活性与对照组相比无显著变化（P＞0.05），但HIS+GSPs 组Ⅰ的MDA 水平显著低于对照组（P＜0.05）；HIS+GSPs 组美洲鳗鲡肝脏CAT 活性显著高于HIS 组（P＜0.05），MDA 水平显著低于HIS 组（P＜0.05），HIS+GSPs 组Ⅱ美洲鳗鲡肝脏T-AOC 和GSH 水平显著高于HIS 组（P＜0.05）；HIS+GSPs 组Ⅰ、Ⅱ间各指标均无显著变化（P＞0.05）。所有组间SOD活性均无变化（P＞0.05）。

3 讨论

血清谷丙转氨酶（GOT）和谷草转氨酶（GPT）属于细胞内酶，正常条件下受细胞膜的屏障保护不易渗出，当鱼类肝细胞受损或器官功能障碍发生时，细胞内转氨酶释放到血液，因此血清转氨酶的变化可以评价肝细胞受损的程度[15]。本试验中，HIS 组美洲鳗鲡血清的GOT 和GPT 活性显著高于对照组，这与兰菲菲[1]在美洲鳗鲡饲料中添加300 mg/kg 组胺，血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著升高的结果一致，说明饲料组胺对美洲鳗鲡肝脏有损伤作用。而在饲料组胺胁迫下添加GSPs，血清中GOT 和GPT活性与对照组相比无显著差异，表明GSPs 能够缓解饲料组胺对肝脏的损伤。饲料镉胁迫下在吉富罗非鱼饲料中添加400 mg/kg GSPs、珍珠龙胆石斑鱼饲料中添加800 mg/kg GSPs 可降低血清的GOT 和GPT 活性[10-11]。GSPs 降低血清的GPT、GOT 活性，缓解肝脏损伤可能与其直接发挥抗氧化能力，清除过多自由基有关；还可能与其减少炎症细胞因子的产生，保持胁迫下肝细胞完整性有关[5,16]。

总抗氧化能力（T-AOC）可以反映鱼体对外界胁迫下分解与清除自由基的代谢能力，是综合评价机体抗氧化系统的指标[17]。谷胱甘肽（GSH）是机体重要的抗氧化因子，能清除损伤细胞的活性氧，维持生物体内氧自由基的代谢平衡[18]；超氧化物歧化酶（SOD）能清除氧化应激产生的超氧化自由基，减轻自由基对肝细胞的损伤[16]；过氧化氢酶（CAT）属于含Fe3+的血蛋白酶，能清除SOD 反应后产生的H2O2，也可阻止ROS对肝细胞的损伤，在肝抗氧化防御体系中发挥重要的作用[19]；丙二醛（MDA）是脂质过氧化产物，由自由基诱导膜脂质过氧化产生，可与蛋白质、氨基酸残基等发生交联聚合反应，对细胞有损伤作用，是评估氧化应激引起肝脏脂质过氧化程度的指标[20]。

图2 GSPs对饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡肝脏抗氧化指标的影响

本试验中，与对照组相比，HIS 组中GSH 水平有降低趋势，机体内产生的GSH不能满足正常的生理功能，而T-AOC 水平和CAT 活性显著降低。说明本试验条件下饲料组胺可降低美洲鳗鲡肝脏抗氧化能力。这与投喂含高组胺的饲料可显著降低黄颡鱼肝脏SOD、CAT 活性，升高MDA 水平，造成肝脏氧化损伤的研究结果一致[21-22]。饲料组胺降低肝脏抗氧化能力的原因可能是过量的自由基大量消耗抗氧化酶，致使肝内氧化与抗氧化系统的失衡，导致脂质过氧化物代谢能力减弱；也与刺激肝脏快速释放IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α等炎症因子从而激活NF-кB 通路，引起炎性反应过激造成肝细胞损伤有关[4,23]。

本试验中，与HIS 组相比，HIS+GSPs 组美洲鳗鲡肝脏CAT活性显著升高，MDA水平显著降低；仅HIS+GSPs 组Ⅱ美洲鳗鲡肝脏T-AOC 和GSH 水平显著升高；HIS+GSPs 组各项指标与对照组接近。说明GSPs能提高美洲鳗鲡肝脏清除自由基和抗氧化能力，一定程度缓解饲料组胺胁迫的氧化损伤。这与吉富罗非鱼饲料添加400 mg/kg GSPs 减少自由基的产生，缓解100 mg/kg镉胁迫下肝胰脏氧化损伤结果类似[24]。此外，添加800 mg/kg GSPs可提高300 mg/kg饲料镉胁迫下珍珠龙胆石斑鱼肝脏CAT活性和降低MDA水平[11]；添加47.6 mg/kg GSPs可提高热应激绿唇鲍SOD活性[13]。GSPs 提高不同胁迫下肝脏抗氧化能力可能的途径是：①通过分子结构的多个酚羟基直接捕获氧化过程中产生的自由基，清除过多的ROS，提高抗氧化酶活性和非酶系物质水平等维持机体抗氧化系统平衡[10]。②阻止脂质过氧化链反应的启动，消除机体被胁迫下脂质过氧化过程中的中间产物LOO-，阻断脂质过氧化链延长，中断自由基链反应，降低MDA 水平[25]。③其分子结构中的羟酚基通过螯合金属离子(如Fe3+、Cu2+、Al3+)，钝化金属离子的活性，抑制催化自由基反应[26]。④通过调节GSH 氧化还原循环来改善细胞氧化还原状态，提高GSH清除自由基和活性氧的能力[27]。

4 结论

综上所述，饲料组胺胁迫下添加300 mg/kg GSPs即可降低美洲鳗鲡的血清转氨酶活性及肝脏丙二醛水平，提高肝脏抗氧化能力，缓解饲料组胺胁迫诱导产生的氧化应激，改善肝脏健康状态。