苦木注射液联用影响阿奇霉素细菌耐药的体外研究

张 杰,孙发鑫,郭文娜,许晓蒙,杨 昕,许 卉

(1.烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台,264005;2.烟台大学化学化工学院,山东 烟台,264005)

大环内酯类抗生素阿奇霉素抗菌谱广,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均具较好抑菌效果,临床上广泛用于治疗敏感菌所致呼吸道、皮肤和软组织感染[1-3]．但由于抗生素滥用广泛,阿奇霉素耐药率逐年上升,给临床抗感染治疗带来巨大挑战[4]．应对阿奇霉素耐药,采用与清热解毒类中药制剂联合应用[5-6],可有效改善临床治疗效果．

苦木注射液是以苦木的茎和枝为原料,经乙醇提取和反复酸碱调节制成的单方制剂,具有清热、解毒、消炎作用,用于感冒、上呼吸道感染、细菌性痢疾等疾病的临床治疗[7]．苦木注射液中包含多种苦木生物碱,目前已有研究表明苦木生物碱对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、溶血性链球菌具有抑制作用[8],但苦木注射液抑菌作用研究基础薄弱且无联合用药相关研究．本课题研究阿奇霉素与苦木注射液联合对阿奇霉素常见耐药致病菌的体外抑制作用,评价分析药物联合抑菌相互作用．

1 材料与方法

1.1 试剂与菌株

注射用阿奇霉素(山东罗欣药业集团股份有限公司;批号:518013152)、苦木注射液(江西青峰药业有限公司;批号:2019063103)、血平板(环凯微生物有限公司)、M-H肉汤培养基(北京三药科技开发公司)、琼脂培养基(北京陆桥技术股份有限公司),金黄色葡萄球菌标准菌株(CMCC(B)26003)、肺炎链球菌标准菌株(CMCC(B)31001)、乙型溶血性链球菌标准菌株(CMCC(B)32210)、痢疾志贺菌标准菌株(CMCC(B)51252)、肺炎克雷伯菌标准菌株(CMCC(B)46117)、大肠埃希氏菌标准菌株(CMCC(B)44103)、铜绿假单胞菌标准菌株(CMCC(B)10211),均购自中国食品药品检定研究院．

1.2 仪器

恒温CO2培养箱(美国Thermo公司),超净台(苏州净化设备有限公司),细菌计数仪(杭州泽析生物科技有限公司),高压灭菌器(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司).

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备 用接种环挑取平板少量菌落,接种于液体培养基,放于37 ℃恒温箱中培养18～24 h． 用无菌生理盐水进行稀释,配制成5×105CFU/mL的菌悬液,用于MIC及FIC测定．

1.3.2 体外抑菌实验 96孔板微量肉汤培养法测定标准菌株金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌最小抑菌浓度(MIC)．选用倍比稀释法稀释药物浓度,药物浓度设定如下:阿奇霉素为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 l、0.125 μg/mL;苦木注射液(以苦木总生物碱计):为4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL[9]．每孔体积200 μL(100 μL药物+100 μL培养基),37 ℃培养箱培养,24 h后黑色背景下肉眼观察结果,以无菌生长的溶液清晰透亮的最低浓度孔药物浓度为MIC．

1.3.3 联合抑菌实验 选用96孔板微量肉汤稀释棋盘法测定部分抑菌指数(FIC)．阿奇霉素与苦木注射液各50 μL联合,96孔板中(1—7行第1—7孔按阿奇霉素浓度4 MIC～1/16 MIC依次加入;1—7列第1—7孔按苦木注射液浓度4 MIC～1/16 MIC依次加入),同时设定阴性对照孔(200 μL液体培养基)以及阳性对照孔(100 μL菌悬液+100 μL液体培养基)．将37 ℃培养箱培养,24 h后黑色背景下肉眼观察结果,无菌生长的溶液清晰透亮的最低浓度孔药物浓度为联用MIC．FIC=联用MIC阿奇霉素/单用MIC阿奇霉素+联用MIC苦木注射液/单用MIC苦木注射液．FIC≤0.5为协同作用;0.52为拮抗作用[10]．

1.3.4 体外诱导耐药 采用体外递增药物浓度法诱导制备阿奇霉素高度耐药菌[11],将原菌液稀释至密度为1×107CFU/mL,取50 μL分别接种于阿奇霉素浓度依次为MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的含药液体培养基中,37 ℃培养箱培养24 h后观察结果．取有菌株生长的最高浓度含药培养基100 μL均匀涂布于相同含药浓度平板,37 ℃培养箱培养24 h后观察是否有菌落生长．挑取含药平板菌落接种于无药液体培养基中制备原菌液,完成第一代诱导．以第一代诱导菌株的最高浓度作为中间值,按上述方法继续类推诱导,直至各菌株耐受256 μg/mL药物浓度,即停止诱导．将菌液涂布于相同浓度平板,37 ℃培养24 h后,挑取单菌落于无药液体培养基中连续传代3次,进行细菌敏感性实验．

2 结 果

2.1 阿奇霉素联合苦木注射液对标准菌株体外MIC及FIC结果

阿奇霉素单用药组MIC测定结果表明,阿奇霉素对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌有相对较强的抑制作用;苦木注射液单用药组MIC测定结果表明,苦木注射液对肺炎克雷伯菌及乙型溶血性链球菌具相对较强的抑制作用;阿奇霉素与苦木注射液联用后MIC值较单药组相比均有明显降低(铜绿假单胞菌除外),阿奇霉素联用MIC较单用组相比整体降低2～8倍,苦木注射液联用MIC较单用MIC降低4～15倍,联合用药对肺炎克雷伯菌作用最显著．计算药物联用FIC值,金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌的FIC≤0.5,具药物联用协同抑菌作用;测定乙型溶血性链球菌FIC范围为0.5

2.2 体外诱导耐药结果

选用7种菌株中药物联合具协同抑制作用的5种菌株(金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌),应用体外递增药物浓度的方法进行人工诱导阿奇霉素耐药菌株．测定体外诱导阿奇霉素耐药菌株MIC,结果表明阿奇霉素对5种株菌的MIC均高于256 μg/mL．根据CLSI标准判断,5种菌株对阿奇霉素产生高度耐药．

2.3 阿奇霉素联合苦木注射液对高度耐药菌株体外MIC及FIC结果

与标准菌株MIC测定结果相比,苦木注射液对系列阿奇霉素高度耐药菌株的MIC值未出现改变;阿奇霉素与苦木注射液联用后MIC值分别较单药组有明显降低,阿奇霉素联用MIC比单用MIC降低4～8倍,苦木注射液联用MIC比单用MIC降低4～8倍,联合用药对肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌体外抑菌作用最显著．根据药物联用FIC值,5种菌株FIC值范围均为 FIC≤0.5,表现为药物联用协同抑菌作用,结果如表2所示．

表1 阿奇霉素与苦木注射液单用及联用对标准菌株的MIC与FIC

表2 阿奇霉素与苦木注射液单用及联用对高度耐药菌株的MIC和FIC(n=30)

3 讨 论

目前抗生素类药物联合中药制剂改善耐药在临床上已非常普遍,主要选择依据是中药制剂相对于抗生素类药物具有多靶点、多通路的抗菌作用机制．中西药联合可显著提高抗生素疗效,扩大抗菌谱,发挥各自优势,降低副作用[12]．

依据7种标准菌株的FIC 测定结果,评价两药联合仅对铜绿假单胞菌呈无关作用,对其他6种菌株均表现为协同/相加作用,可显著降低阿奇霉素MIC值,表明阿奇霉素联合苦木注射液具有较强的体外抑菌活性．同时评价阿奇霉素与苦木注射液联用对耐药菌株体外抑制作用,与标准菌株MIC测定结果相比,苦木注射液单用药组对系列阿奇霉素高度耐药菌株的MIC值未改变,表明诱导阿奇霉素高度耐药不改变苦木注射液对相应菌株的抑菌作用;依据5种高度耐药菌株MIC值测定结果,表明两药联用能显著降低高度耐药菌MIC值至32 μg/mL、64 μg/mL,有效改善阿奇霉素耐药性．

4 结 论

阿奇霉素联合苦木注射液对高度耐药菌株金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌具协同抑制作用,对肺炎克雷伯菌联合抑菌作用最显著．鉴于本实验仅为体外抑菌实验,对体内阿奇霉素与苦木注射液联用药物-药物相互作用有待进一步研究．