HAG联合地西他滨对骨髓增生异常综合征患者炎性因子、HIF-1α、VEGF表达的影响

刘欣 刘艳芬 訾建杰 舒郁 孔令喆 郑倩 闫慧 韩宝艳

骨髓增生异常综合征(MDS)是造血干/祖细胞分化发育异常导致骨髓造血功能衰竭、外周全血细胞减少的一组异质性克隆性疾病[1,2]。MDS发病机制复杂，其中骨髓微环境炎性因子、低氧诱导因子1α(HIF-1α)及其下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)表达异常在MDS发生发展中发挥关键作用，参与调控细胞增殖、凋亡及多药耐药性[3,4]。本研究探讨了HAG(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷+粒细胞集落刺激因子)联合地西他滨对MDS患者炎性因子、HIF-1α、VEGF表达的影响，以期为此类疾病的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2014年2月至2015年1月我院收治的MDS患者86例，随机分为HAG组和联合组，每组43例。HAG组男24例，女19例；年龄26～71岁，平均(54.3±6.5)岁；分型：难治性贫血伴原始细胞增多-2 27例，难治性贫血伴原始细胞增多-1 11例，MDS转化急性髓系白血病(AML)4例，慢性-单核细胞白血病1例；IPSS分组：中危-1 15例，中危-2 22例，高危6例。联合组男25例，女18例；年龄25～72岁，平均(53.4±6.0)岁；分型：难治性贫血伴原始细胞增多-2 26例，难治性贫血伴原始细胞增多-1 12例，MDS转化AML3例，慢性-单核细胞白血病2例；IPSS分组：中危-1 13例，中危-2 25，高危5例。2组性别比、年龄、分型、IPSS分级比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：(1)符合MDS相关诊断标准[5]；(2)所有患者具有全血细胞减少、造血功能衰竭等典型表现；(3)患者及家属签署知情同意书。 排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)肝肾等重要脏器功能障碍者；(3)精神疾病患者；(4)入组前6个月服用过影响造血功能的药物者；(5)对治疗药物过敏者；(6)妊娠期或哺乳期女性患者。

1.3 治疗方法 2组均给予抗感染、营养支持治疗。HCG组给予高三尖杉酯碱(辰欣药业股份有限公司，1 ml∶1 mg)+阿糖胞苷(海正辉瑞制药有限公司)+粒细胞集落刺激因子(协和发酵麒麟株式会社)治疗。高三尖杉酯碱，1 mg/d，1次/d，溶于250 ml 5%葡萄糖注射液中，静脉滴注；阿糖胞苷，2 mg/kg，1次/d，静脉滴注；粒细胞集落刺激因子，300 μg/d，1次/d，静脉滴注。连用14 d。联合组在HAG组治疗基础上加用地西他滨(正大天晴药业集团股份有限公司)，15 mg/m2，1次/8 h，静脉滴注。连用3 d。

1.4 实验方法

1.4.1 造血功能:采集患者空腹静脉血，离心取上清，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清GDF11、可溶性转铁蛋白(sTfR)含量。

1.4.2 炎性因子:采用ELISA测定血清白介素13(IL-13)、白介素10(IL-10)水平。

1.4.3 HIF-1α、VEGF:采用ELISA测定血清低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)水平。

1.4.4 Real time-PCR:采集骨髓液5 ml，置于肝素抗凝管中，等量PBS稀释后加入淋巴细胞分离液，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(BMMNC)。Trizol提取BMMNC总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA第一链，Real time-PCR法测定HIF-1α、VEGF mRNA表达量，设β-actin为内参照基因，目的基因表达相对值为2-ΔΔCt。

1.4.5 Western blot:提取BMMNC总蛋白，经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，室温下10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，TBST洗膜3次。ECL化学发光法显色、定影。

1.4.6 预后:采用ELISA测定血清乳酸脱氢酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、铁蛋白(SF)。记录2组向AML转化率。

2 结果

2.1 2组造血功能比较 2组治疗前血清GDF11、sTfR差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后血清GDF11、sTfR均较治疗前降低(P<0.05)，且联合组GDF11、sTfR低于HAG组(P<0.05)。见表1。

表1 2组造血功能比较

2.2 2组血清炎性因子比较 2组治疗前血清IL-13、IL-10比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后血清IL-13均较治疗前显著升高，IL-10均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组IL-13高于HAG组，IL-10低于HAG组(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清炎性因子比较

2.3 2组血清HIF-1α、VEGF比较 2组治疗前血清HIF-1α、VEGF比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后血清HIF-1α、VEGF均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组HIF-1α、VEGF低于HAG组(P<0.05)。见表3。

2.4 2组BMMNC HIF-1α、VEGF表达比较 2组治疗前BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达低于HAG组(P<0.05)。见表4。

表3 2组血清HIF-1α、VEGF比较

表4 2组BMMNC HIF-1α、VEGF表达比较

2.5 2组预后相关指标比较 2组治疗前LDH、β2-MG、SF比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后LDH、β2-MG、SF均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组LDH、β2-MG、SF低于HAG组(P<0.05)。见表5。

表5 2组预后相关指标比较

2.6 2组向AML转化率比较 HAG组、联合组向AML转化率分别为27.91%(12/43)、16.28%(7/43)，联合组向AML转化率低于HAG组(P<0.05)。见表6。

表6 2组向AML转化率比较 n=43，例(%)

3 讨论

MDS是一组以髓系细胞异常分化、病态造血为特征的造血干细胞疾病，80%的患者表现为不同程度的外周全血细胞减少，向急性髓系白血病转化风险高，严重威胁患者生命安全[6,7]。我们前期研究证实，HAG联合地西他滨治疗MDS临床缓解率高于单纯HAG治疗，且安全性高[8]。本研究进一步探讨联合用药的治疗机制，旨在为疾病治疗提供理论依据。

GDF11是TGF-β超家族的重要成员，通过参与晚期红细胞成熟、分化发育调控骨髓造血功能。研究发现，MDS患者血清GDF11水平升高，且与预后密切相关[9]。sTfR是反映机体铁储存量、骨髓幼红细胞比例及红系造血功能的主要指标[10]。本研究结果显示，2组治疗前血清GDF11、sTfR比较无差异差异(P>0.05)；2组治疗后血清GDF11、sTfR均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组低于HAG组(P<0.05)，提示联合组能够有效改善MDS患者造血功能，延缓疾病进展，疗效优于单纯HAG治疗。

目前，MDS发病机制尚未阐明，研究发现骨髓造血微环境异常在疾病发生发展中起重要作用[6-10]。IL-13是活化T细胞分泌的细胞因子，具有诱导B细胞增殖分化并抑制炎性反应等作用。IL-10是参与调控机体免疫炎性反应的重要细胞因子，并可作用于Th1细胞抑制IFN-γ的分泌和释放[11]。本研究结果显示，2组治疗前血清IL-13、IL-10比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后血清IL-13均较治疗前显著升高，IL-10均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组IL-13高于HAG组，IL-10低于HAG组(P<0.05)，提示联合组能够通过调控炎性因子分泌纠正免疫紊乱，从而改善骨髓造血功能。

HIF-1α是缺氧状态下被激活的转录激活因子，肿瘤细胞由于增殖代谢旺盛，导致HIF-1α降解受阻及水平增高[12]。研究发现，MDS患者血清HIF-1α水平增高，通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、耐药性参与肿瘤致病过程[13]。另外，HIF-1α能够调控VEGF等下游靶基因的表达调控血管新生，从而参与肿瘤发生发展[14]。研究显示，本研究结果显示，2组治疗前血清HIF-1α、VEGF及BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后血清HIF-1α、VEGF及BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组以上指标变化程度较HAG组明显(P<0.05)，说明联合组通过下调HIF-1α、VEGF表达抑制肿瘤血管新生。

LDH是机体损伤和代谢紊乱时分泌的一种糖酵解酶，在白血病、恶性肿瘤细胞表达上调[15]。β2-MG 是白细胞、淋巴细胞等分泌的一种球蛋白，其在健康人血清水平极低，当炎症应激状态或恶性肿瘤细胞表达增高，参与调控细胞增殖[16]。SF是一种可溶性铁蛋白，在MDS等血液系统恶性肿瘤患者血清水平增高，可作为判断疾病治疗效果及预后的敏感指标[17]。本研究结果表明，2组治疗前LDH、β2-MG、SF比较无差异(P>0.05)；2组治疗后LDH、β2-MG、SF均较治疗前显著降低(P<0.05)，且联合组低于HAG组(P<0.05)；此外，HAG组、联合组向AML转化率分别为27.91%(12/43)、16.28%(7/43)，联合组向AML转化率低于HAG组(P<0.05)。说明联合组能够显著降低MDS向AML转化率，改善患者预后，机制与调控炎性因子、HIF-1α、VEGF表达有关。

综上所述，HAG联合地西他滨能够改善MDS患者造血功能及预后，机制与调控炎性因子、HIF-1α、VEGF表达有关。