木犀草素铜配合物的制备及其对DNA的裂解作用研究

臧 昕，王家文，林 悦，杨 昆，李 欢，申贵男，李 婧

(黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

木犀草素(3',4',5,7-Tetrahydroxy Flavone)，具有多样的生物化学和药理作用，如抗菌、抗氧化、降血脂及胆固醇等。近期研究发现，金银花、荆芥、菊花等天然中药材中的木犀草素在用作抗病毒药物时，对SARS-CoV-2的主要蛋白酶结合位点具有很高的亲和力[1]。木犀草素在与锌、锰、镁等微量元素形成配合物后，部分生理活性得到明显提升，并具有更加多样的生物特性[2-5]。开发新型木犀草素金属配合物，有利于了解黄酮类化合物与金属的络合形式，研究新型具有生理活性的物质。本实验用木犀草素分别与新戊酸酮、苯甲酸铜进行反应制成铜配合物，分析其化学组成，并研究配合形式及对DNA的裂解能力。

1 实验部分

1.1 实验仪器、药品

样品的红外谱图以KBr为压片材料在Nicolet 380 型红外光谱仪上测得；紫外谱图由Thermo Scientific 紫外分光光度计测得；元素分析在Vario Micro cube上测定，凝胶电泳使用美国BIO-RAD紫外凝胶成像系统进行图谱分析。

琼脂糖购自Spanish公司；pBR322 DNA购自美国Fermentas公司；EB(溴化乙锭)购自北京博奥拓达；木犀草素购自上海贤鼎公司。

1.2 合成步骤

1.2.1 配合物1的合成

木犀草素(4 mmol)充分溶解于10 mL无水乙醇，新戊酸酮(2 mmol)充分溶解于10 mL无水乙醇；将溶液混合并震荡，置于75℃水浴中回流70 min，冷却，过滤，收集沉淀，干燥后即得黑色产物，产率为78.66%。IR(峰值，cm-1)：3423 s,1637 m,1590 m,1535 w,1482 s,1350 m,1257 s,809 m。

1.2.2 配合物2的合成

木犀草素(4 mmol)充分溶解于10 mL无水乙醇，苯甲酸酮(2 mmol)充分溶解于10 mL无水乙醇；将溶液混合并震荡，置于75℃水浴中回流70 min，冷却，过滤，收集沉淀，干燥后即得黑色产物，产率为73.35%。IR(峰值，cm-1)：3432 s,1630 m,1600 m,1600 s,1534 w,1480 m,1351 m,1256 m,810 m。

1.3 配合物对pBR322 DNA的裂解实验

1.3.1 原料与产物对pBR322 DNA的作用能力

以琼脂糖凝胶电泳法测试木犀草素及其铜配合物对pBR322 DNA的作用效果，并通过美国BIO-RAD紫外凝胶成像系统来分析所得图像。

将木犀草素、新戊酸铜、苯甲酸铜、铜配合物1、铜配合物2充分溶解于 DMSO，调节各样品浓度，使其均为300 μg/mL。向每个EP管中加入1 μL的各样品，接着将6 μL的pH值为7.3的Tris-HCl缓冲溶液加入其中，再滴入1 μL的pBR322 DNA(150 μg/mL)，均匀混合，使体积总和为8 μL；同时以1 μL DMSO溶剂代替样品，设置DNA阴性对照组。

将溶液混合均匀，于37℃恒温、避光的环境中水浴反应3 h。待反应时间达到后，将 2 μL的Loading buffer与刚取出的8 μL产物迅速、均匀混合，上样到具有溴化乙锭(1.0 μg/mL)的琼脂糖凝胶板(琼脂糖含量：0.8%)上，在电泳仪中加入配制好的TAE缓冲溶液，在80 V/cm的电压下进行持续电泳。

1.3.2 木犀草素配合物浓度对pBR322 DNA的裂解能力的影响

将配合物1和配合物2的样品，依次稀释为7个质量浓度：300，225 ，150 ，75，37.5 ，18.75，9.38 μg/mL。取1 μL各浓度的样品样品与1μL 的pBR322 DNA(150 μg/mL)作用，操作步骤同上。

2 结果与分析

2.1 木犀草素铜配合物产率分析

将木犀草素与新戊酸酮和苯甲酸铜，分别按照以下6种物质的量比进行反应， 0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，反应中固定木犀草素用量。反应物在乙醇中于75℃恒温水浴中，持续反应70 min，结果如下图1所示。随着物质的量之比不断增加，至比值为1时，两种配合物产率均达到最高，分别为78.66%(配合物1)和73.35%(配合物2)，然后反应产率持续下降。因此物质的量之比1∶1为最佳物质的量比。在制备配合物的过程中，其他溶剂如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等也用来探索反应，但是实验产品产率均不如在乙醇中好。

图1 不同物质的量之比对产率的影响

2.2 木犀草素铜配合物的化学表征

2.2.1 红外谱图解析

木犀草素与铜配合物1和2的主要红外吸收峰峰值如表1所示。

表1 木犀草素及其铜配合物的主要红外吸收峰归属

与木犀草素相比较，配合物的羰基C=O吸收峰由1655 cm-1移到1637 cm-1和1630 cm-1，分别减少22 cm-1和25 cm-1，说明两配合物中C环上的4-羰基均进行了配位。芳环C=C键由1612 cm-1分别减少至1591 cm-1和1600 cm-1。此外，两配合物于809cm-1和810 cm-1处的特征吸收峰表明均存在金属氧键，证明木犀草素的确与铜离子发生了配位。配合物中双酚羟基C-OH的吸收峰分别下降18 cm-1和17 cm-1，说明双酚结构保存，但由于受配位影响，发生位移。在配合物1中未发现新戊酸根的吸收峰，说明新戊酸根没有参与到配合物的形成，同样苯甲酸根也没有参与配合物的形成。以上分析表明，配合物的结构组成为4-羰基，5-羟基配位铜的配合物。

2.2.2 紫外-可见光谱解析

木犀草素与铜配合物1和2的紫外特征吸收带分布如表2所示。

表2 木犀草素及其铜配合物的紫外主要吸收峰波长

将木犀草素和配合物用DMSO溶解，配置成25 μg/mL的溶液，并在200 nm至600 nm光谱区间，在紫外分光光度计上进行紫外光谱扫描。

木犀草素在紫外光谱中出现两个特征吸收峰，位于355 nm处吸收峰为带Ⅰ，是环B的苯甲酰基，位于257 nm处的吸收峰为带Ⅱ，是环A的桂皮酰基[6]。这两处吸收峰均是由于发生ππ→π*跃迁引起[7]。配合物1和2的带Ⅱ的吸收峰依次为266 nm和263 nm，较木犀草素有小幅度红移，带I的最大吸收峰较木犀草素分别红移了80 nm和77 nm。

羟基黄酮类化合物通常有两种配位位点，3'-OH、4'-OH和4-CO、5-OH。文献报道木樨草素多以4-CO、5-OH的形式发生配位[7-9]。在本文铜配合物中木犀草素与铜离子发生配位，配位点也是C环上的4-CO和A环上的5-OH，形成稳定的环状结构，此类情况配位时，4-CO通过共轭，影响到A环和B环两个共振体系能级降低，从而导致两个吸收峰发生红移。

图2 木犀草素铜配合物分子结构

综合上述红外与紫外谱图中分析，考虑到峰顶取点误差，两组数据中吸收峰值的差别可以忽略。因此可以判断配合物1和2在化学结构上相同，且酸根未参与配合物的形成。对配合物进行元素分析得到C:55.78%，H:2.96%；理论值C:55.26%，H:3.09%，推断该配合物的结构式如图2所示，分子中含有水分子。

2.3 木犀草素铜配合物对DNA裂解作用

作为具有抗四环素和氨苄青霉素的基因载体，超螺旋pBR322 DNA常常被用于测试化合物抗菌能力[8]。pBR322 DNA的Form I是超螺旋结构，在与金属作用后会发生解超螺旋现象，形成Form II。本实验中，将反应所用原料(木犀草素、苯甲酸铜、新戊酸酮)与反应所得到的配合物1和配合物2进行对DNA裂解能力比较，如图3所示。木犀草素、苯甲酸铜和新戊酸酮对DNA裂解率分别为4.56%、6.71%、5.13%，基本无裂解能力，而配合物1和配合物2达到了则78.39%和 82.27%，说明木犀草素与Cu2+发生配合后，对pBR322 DNA的裂解能力有着显著提升。此处表明两种方法合成的样品，具有相同的性能，进一步证明配合物结构相同。

1-Naked DNA；2-木犀草素；3-苯甲酸铜；4-新戊酸酮；5-配合物1；6-配合物2

为了进一步研究配合物的裂解作用，实验选用配合物2测试在不同浓度下对DNA的裂解情况，如图4。在配合物2中，随着浓度的提高，裂解率也有着明显的上升，在75 μg/mL时表现出裂解作用，且在300 μg/mL时，裂解率达到了最高84.16%。

1-DNA；2-DNA+9.38μg/mL；3-DNA+18.75μg/mL；4-DNA+37.5μg/mL；5-DNA+75.0μg/mL；6-DNA+150 μg/mL；7-DNA+225μg/mL；8-DNA+300μg/mL

3 结论

木犀草素金属配合物具有多种生物活性，在本实验中，利用木犀草素与新戊酸铜和苯甲酸铜分别反应生成配合物1和配合物2，利用红外、紫外光谱等方法分析了木犀草素铜配合物的化学组成，并初步推测出在这两种方法下合成的配合物结构相同，木犀草素通过C环上的4-C=O和A环上的5-OH与铜发生配位。此种配位形式在黄酮类化合物金属配位物中较为典型。通过对pBR322 DNA的裂解活性研究表明，原料样品对DNA没有裂解作用，而在生成木犀草素铜配合物后，DNA裂解能力有了明显的提升，并且随着浓度的增大，裂解能力增强。此项研究为后续木犀草素铜配合物的深入研发奠定基础。