大别山区域树舌灵芝和云芝抗氧化活性研究

陈颐辉

(信阳农林学院 生物与制药工程学院，河南 信阳 464000)

多孔菌科真菌 (Polyporaceac) 隶属于真菌界 (Fungi) 担子菌门 (Basidiomycota) 担子菌纲 (Basidiomycetes) 伞菌亚纲 (Agaricomycetidae) 多孔菌目 (Polyporales)[1]，自然界已知的多孔菌科真菌约有500多种，中国发现300余种。多孔菌科真菌是一类研究利用较多的大型真菌，拥有较高的食药用价值，如可食用的灰树花、地花菌、硫磺菌等；常被用作中药材的灵芝，紫芝，茯苓、猪苓等[2]，含有较强生理活性，具有滋补、健脑等功效，且具有良好的免疫活性、抗肿瘤活性、抗氧化活性等的药用价值[3]。

大别山地区因其富饶的植被资源和适宜的环境，蕴含丰富的多孔菌科真菌资源，各学者也有针对其中菌种的药理活性进行研究，但相关研究多集中于对灵芝(Ganoderma Lucidum Karst)，紫芝(Ganoderma sinense)等的多糖，萜类化合物[3-4]，其他菌株与成分研究则相对较少。多孔菌科真菌的抗氧化物可作用于清除自由基，减少脂质过氧化物的形成，增强机体抗氧化损伤的能力，防治肿瘤等[5]，同样具有巨大的研究潜力。树舌灵芝具有抗肿瘤、抗衰老、免疫调节抗病毒等功效，云芝具有恢复和增强带肿瘤机体的免疫功能、防癌抗癌等功效[6-7]，但其抗氧化活性的特点目前研究较少。

本研究选择大别山地区野生树舌灵芝和云芝作为实验材料，以信阳农林学院人工培养灵芝为对照材料，分离培养获得树舌灵芝和云芝的纯种培养物；通过研究超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的酶活性来探究其抗氧化活性特点，进而挖掘大别山地区多孔菌科真菌的种质资源特点。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

树舌灵芝与云芝栓孔菌均来自于大别山区域野外采摘，选择信阳农林学院人工栽培灵芝为对照。二硫代对二硝甲基苯甲酸，邻苯三酚，青霉素和链霉素等试剂均为分析纯。

5415D微型离心机、UV752N紫外可见分光光度计、HH-6型数显恒温水浴锅、DNP电热恒温培养箱、MS105DU电子分析天平、QHZ - 98A全温度振荡培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养及粗酶液制备

将树舌灵芝、云芝及灵芝表面冲洗干净，再用无菌水冲洗2～3次。无菌环境下，选取菌柄和菌盖边缘间的中心位置，用无菌手术刀切割0.3cm左右的组织块，压入加有青霉素和链霉素的PDA培养基中培养，在25℃恒温培养箱中培养，待菌落长至直径为2～3cm时，挑选少量菌丝在PDA培养基上纯化2～4次，将纯种菌丝转接至PDA液体培养基中，25℃恒温摇床震荡培养12天[8]。无菌抽滤得到菌丝体，各称取材料0.1g，加入预先配制过的pH值7.8的0.05mol/L磷酸钠缓冲液5mL，冰浴研磨。在4℃ 10 000r/min高速离心15min，收集上清液，随后用以测定酶活性[9]。

1.2.2 酶活性的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性[9]，参照郝俊江等[9]的方法测定CAT活性，参照王迟早等[10]的方法测定GPX活性，每组试验重复三次，取数据平均值。

用Excel软件对试验数据进行统计。

2 实验结果与分析

2.1 超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)是一类金属酶,广泛存在于生物体内，可以特异性地催化超氧阴离子的歧化反应[11]。

由图1可知树舌灵芝和云芝的SOD活性均高于对照，其中云芝的SOD活性最高，达到85.40U/g，高于对照14.5%，树舌灵芝的SOD活性同样高于对照10.4%。

图1 树舌灵芝、云芝与灵芝的超氧化物歧化酶活性对比 (单位：U/g)

2.2 过氧化氢酶活性

过氧化氢酶(CAT)可以阻止H2O2与细胞中产生的超氧阴离子自由基进一步生成羟自由基，从而防止自由基对细胞的损伤[12]。

由图2可知实验材料的树舌灵芝和云芝的CAT活性均高于对照组材料，酶活性分别为38.63U/g·min，39.67U/g·min，分别高于对照6.4%、9.3%。

图2 树舌灵芝、云芝与灵芝的过氧化氢酶活性对比(单位：U·g-1·min-1)

2.3 谷胱甘肽过氧化物酶活性

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是Mills等发现一种自由基捕获剂，具有很典型的抗氧化活性[11]。

由图3可知，树舌灵芝和云芝的GPX活性均高于对照组材料，其中树舌灵芝的GPX活性最高，为56.79U/mL，高于对照11.0%，云芝的GPX活性53.70U/mL，同样高于对照10.4%。

图3 树舌灵芝、云芝与灵芝的谷胱甘肽过氧化物酶活性对比 (单位：U/mL)

3 讨论

从图1可知，三种材料虽在同一培养条件下生长，但不同菌丝生长状态不同，且根据赵丹等[11]试验可知随着培养时间的延长灵芝的SOD活性减退较快,而实验组的SOD活性均高于对照，这说明野外采摘的树舌灵芝和云芝具有较强的SOD活性。付欣[6-7，13]等的实验数据可以看出，树舌灵芝和云芝相关酶的抗肿瘤活性更大，因此也可以间接证明其所含CAT和GPX活性也相应要高。但是本实验主要研究的是菌丝体时期的三种酶活性，根究郝俊江[7]等的研究，可以发现不同菌种在不同生长周期的酶活性存在差异，因此本次试验只能证明菌丝体时期的三种酶活性差异，具体其他生长周期的SOD、CAT、GPX活性还需要进一步研究。

4 结论

本研究首次对大别山区域野生树舌灵芝和云芝的抗氧化活性进行了研究，结果表明树舌灵芝和云芝菌丝体的SOD、CAT和GPX酶活性均高于对照灵芝，而云芝的SOD和CAT活性又较之大于树舌灵芝，这说明大别山区域的野生多孔菌科真菌具有良好的抗氧化活性。然而，本试验只探究了多孔菌科真菌菌丝体某一生长阶段的酶活性差异，但菌丝体不同生长时期其酶活性也存在差异，因此今后可针对菌丝体整个生长周期，甚至子实体阶段的抗氧化活性进行研究。