施他宁缓解急性胰腺炎胰腺腺泡细胞线粒体损伤的研究

徐蒙 崔青 李顺乐 马建仓 陈熹 任一凡

1西安交通大学第二附属医院普外科，西安 710004；2西安市中心医院心内科，西安 710003

AP的发病常伴随着线粒体功能的紊乱，而线粒体功能紊乱可导致多种组织器官功能异常[1-2]。以往研究证实，减轻线粒体功能的损伤可以有效地缓解肝脏缺血再灌注损伤的程度[3]。施他宁是一种有效缓解急性胰腺炎症状的生长抑素，因显著的治疗效果而被广泛地应用于临床，但其对胰腺腺泡细胞的作用机制仍未可知。本研究旨在探讨施他宁对AP相关胰腺腺泡细胞线粒体损伤的影响，为阐明施他宁的药理机制提供新的思路。

材料与方法

一、动物模型建立及分组

24只雄性C57BL/6小鼠(体重18～22 g)购自西安交通大学医学部动物实验中心，标准条件下饲养1周以适应环境。将24只小鼠按数字表法随机分为对照组、AP组及AP+施他宁治疗组(施他宁组)，每组8只。实验程序均符合国际实验动物护理和使用指南，并获得西安交通大学医学院第二附属医院动物伦理委员会的批准。

所有小鼠在实验前12 h禁食，自由饮水。AP组采用腹腔注射20%左旋精氨酸(4.0 g/kg，美国Sigma公司)，1 h后再次注射相同剂量左旋精氨酸的方法制备AP模型；施他宁组在制模后2 h腹腔注射0.4 mg/kg施他宁(瑞士Serono公司)；对照组小鼠腹腔注射等容积生理盐水。首次精氨酸注射后72 h处死小鼠，眼眶取血，剖腹取胰腺。

二、观察指标

1．胰腺组织病理学检查：胰腺组织常规固定、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，光镜下观察胰腺组织的损伤程度，并根据水肿、炎症细胞浸润、出血和坏死程度进行进行病理评分[4]。

2．血清淀粉酶和脂肪酶检测：应用血清淀粉酶和脂肪酶检测试剂盒检测各组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶的水平。试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，具体操作方法参照说明书。

3．血清IL-6、IL-10、TNF-α水平检测：采用ELISA法检测血清IL-6、IL-10、TNF-α水平。试剂盒均购自武汉云克隆公司，检测步骤参照说明书。

4．胰腺腺泡细胞内线粒体检测：采用Mitotracker红色荧光标记法观察线粒体的损伤情况。胰腺组织做冰冻切片，应用Mitotracker染料进行染色。胰腺腺泡细胞的线粒体会被Mitotracker染料标记为红色，损伤加重的线粒体荧光强度会减弱。在荧光显微镜下观察并拍照，每张切片400倍下随机拍3张视野，并用imageJ Pro软件对各组荧光照片定量。

5．胰腺组织ND-3蛋白表达量检测：采用常规蛋白质印迹法检测ND-3蛋白表达，以β-actin为内参。兔抗鼠ND-3一抗购自美国ABCAM公司，工作浓度1∶1 000，羊抗兔IgG-HRP二抗购自中国碧云天公司，工作浓度1∶5 000。最后ECL发光，X片曝光显影、定影。应用凝胶成像仪扫描蛋白条带，并用仪器自带的Image J软件进行条带灰度的定量分析，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

6．胰腺组织线粒体融合蛋白2(mitofusion2，Mfn2)和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)蛋白检测：采用免疫组织化学染色法检测胰腺组织Mfn-2、TFAM蛋白表达量。兔抗鼠Mfn2单克隆抗体(美国CST公司)工作浓度1∶1 000，兔抗鼠TFAM抗体(美国ABCAM公司)工作浓度1∶1 000，二抗1∶5 000。光镜下观察3处不同的视野，深棕色染色区域为蛋白阳性表达区域，应用Image J pro软件对阳性面积进行定量。

7．胰腺组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平检测：用组织破碎仪制备胰腺组织匀浆，采用SOD、GSH试剂盒检测SOD、GSH活性；采用脂质过氧化工具包检测MDA水平。试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，按说明书操作。

三、统计学处理

结 果

一、施他宁减轻AP小鼠胰腺组织损伤

对照组小鼠胰腺组织无明显病理改变；AP组小鼠胰腺组织明显水肿、出血和坏死；施他宁组胰腺组织水肿、出血和炎症细胞浸润程度较AP组明显减轻，坏死面积明显减少(图1)。对照组、AP组、施他宁组小鼠胰腺病理评分分别为(0.47±0.31)、(3.93±0.64)、(2.07±0.50)分，AP组显著高于对照组，施他宁组显著低于AP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，表明施他宁可以有效地减轻AP胰腺的损伤程度。

对照组、AP组、施他宁组小鼠血清淀粉酶水平分别为(1 094±250)、(1 832±86)、(1 493±172)U/L；脂肪酶水平分别为(237.0±96.8)、(671.0±164.5)、(225.4±83.2)U/L，AP组显著高于对照组，施他宁组显著低于AP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，表明施他宁能有效地减少胰腺腺泡细胞的坏死。

二、施他宁缓解AP小鼠的全身炎症反应

对照组、AP组、施他宁组小鼠血清IL-6水平分别为(55.88±13.53)、(358.60±139.22)、(99.09±36.65)ng/L；TNF-α分别为(20.39±4.56)、(40.83±1.62)、(22.75±11.24)ng/L；IL-10分别为(17.48±7.05)、(9.92±8.73)、(15.12±5.03)ng/L。AP组IL-6、TNF-α水平显著高于对照组，施他宁组显著低于AP组；AP组的IL-10水平显著低于对照组，施他宁组显著高于AP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示施他宁可以有效地抑制促炎因子，升高抑炎因子，从而减轻炎症反应。

三、施他宁减轻AP小鼠胰腺细胞线粒体的损伤

对照组、AP组、施他宁组小鼠胰腺组织Mitotracker相对荧光密度分别为107.67±17.62、40.00±10.15、71.67±17.62(图2)，AP组小鼠胰腺细胞内线粒体数量较对照组减少约60%，而施他宁较AP组的线粒体数量增加约40%。代表线粒体数量的ND-3蛋白在对照组、AP组、施他宁组小鼠胰腺组织的表达量分别为1.02±0.12、0.11±0.05、0.45±0.16，AP组ND-3蛋白表达量显著低于对照组，施他宁组显著高于AP组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示施他宁可以增加AP时胰腺腺泡细胞的线粒体数量。

图2 对照组(1)、AP组(2)、施他宁组(3)小鼠胰腺腺泡细胞线粒体数量(2A～2C：Mitrotracker染色；2D～2F：细胞核；2G～2I：融合图)

四、施他宁保护AP小鼠胰腺细胞线粒体的功能

对照组、AP组、施他宁组小鼠胰腺组织TFAM表达量分别为100%、54%、78%；Mfn-2蛋白表达量分别为100%、47%、86%(图3)，AP组较对照组显著减少，施他宁组较AP显著增加，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示AP时胰腺腺泡细胞线粒体发生和融合的功能受损，施他宁可以有效增加TFAM和Mfn-2蛋白的表达。

五、施他宁缓解AP小鼠胰腺组织氧化应激反应

对照组、AP组、施他宁组小鼠胰腺组织MDA分别为(2.90±0.17)、(7.33±2.08)、(5.00±1.73)nmol/mg蛋白；SOD水平分别为(21.33±4.04)、(8.67±2.07)、(17.33±3.21)U/mg蛋白；GSH分别为(143.33±12.01)、(77.33±29.69)、(131.33±20.55)U/mg蛋白。AP组MDA显著高于对照组，施他宁组显著低于AP组；AP组SOD、GSH显著低于对照组，施他宁组显著高于AP 组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，提示施他宁有效缓解了AP时胰腺组织的氧化应激反应。

图3 对照组、AP组、施他宁组小鼠胰腺腺组织Mfn-2(3A～3C)和TFAM(3D～3F)蛋白表达(免疫组织化学染色)

讨 论

AP发生时，胰腺组织局部的损伤坏死所造成的腺泡细胞内容物外漏可以引起炎症递质释放，不断加剧的胰腺组织损伤引起炎症递质大量激活并释放入血可以引发全身炎症反应综合征[5]，造成多个远隔器官损伤并最终导致患者死亡[6]。本研究发现，施他宁不仅可以缓解AP小鼠胰腺组织炎症细胞的浸润，更可以下调血清中IL-6、TNF-α等炎症递质的水平从而减轻全身炎症反应，促进AP病情的局限以及转归。线粒体损伤在AP的发生发展中扮演着重要的角色[7]。Mukherjee等[8]最近的一项研究表明，在左旋精氨酸诱导的AP中，高淀粉酶血症、胰蛋白酶原激活、坏死、空泡化和炎症都是因线粒体功能障碍介导的线粒体损伤所造成的。正常的线粒体功能离不开线粒体正确的发生以及稳定的融合[3]，TFAM蛋白和Mfn-2蛋白分别代表了线粒体发生以及线粒体融合水平，线粒体损伤不仅造成线粒体数目的减少，同样造成线粒体功能的改变[1]。

本课题组前期的研究已经证实，线粒体数目和功能的损伤在AP的发病进程中处于核心位置，线粒体功能受损可以引起细胞发生氧化应激和内质网应激并最终导致细胞死亡[7]。本研究发现，施他宁不仅可以保护胰腺腺泡细胞线粒体的数目，并且可以恢复降低的Mfn-2以及TFAM蛋白的水平，这说明施他宁可以在保护线粒体数目的同时，避免线粒体发生和融合的功能受到损害。在AP小鼠模型中，线粒体功能障碍可能是由钙超载或非钙超载机制引起的[8]。左旋精氨酸通过抑制F-ATP合酶的活性，即非钙超载途径诱导AP的发生[9]。本研究结果证实施他宁在非钙依赖AP小鼠模型中是有益的，这表明它有可能用于治疗非钙离子超载导致的AP的患者。

线粒体损伤不仅可以造成胰腺腺泡细胞能量供应障碍，也可以进一步地引起细胞氧化应激以及内质网应激[10]，氧化应激的持续存在可以反过来加重线粒体功能的紊乱，加速胰腺腺泡细胞的损伤和坏死[11]。线粒体功能紊乱所造成的能量失衡，伴随细胞过氧化造成的细胞器损伤，可以引发内质网应激，导致内质网内多种功能蛋白的错误折叠和组合，进一步加重胰腺腺泡细胞功能的丧失。严重的内质网应激还可以诱发凋亡相关蛋白CHOP的表达升高，介导活化下游的Caspase 3以及BAX等凋亡相关基因，最终导致细胞发生凋亡[7,12]。本研究结果显示施他宁同时可以缓解AP小鼠胰腺组织的氧化应激水平，更进一步减轻了AP小鼠胰腺腺泡细胞的损伤程度，缓解了AP病情。

综上所述，施他宁可以缓解AP小鼠胰腺腺泡细胞中线粒体功能以及数目的损伤和减少，进而减轻胰腺组织氧化应激的水平，并最终保护受损的胰腺组织，改善全身炎症反应的情况。但是施他宁改善胰腺腺泡细胞线粒体功能的具体作用靶点目前尚未可知，本课题组将更进一步地探索施他宁保护线粒体功能的具体分子机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突