响应面法优化黑参中类黑精的提取工艺

陈立彪，朱凤妹，李军*

河北科技师范学院（秦皇岛 066000）

类黑精是一种结构非常复杂，颜色呈深褐色，主要由羰基化合物（还原糖、不饱和脂肪酸、醛、酮等）与氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质等含氮化合物的游离氨基）之间发生美拉德反应生成的一种大分子高聚物[1]，具有抗氧化活性[2]、促进铁吸收[3]、抑菌[4]、降血压[5]等生理作用。黑参经九蒸九曝加工完成后富集了大量类黑精物质[6]，将其从材料中充分提取，可保证类黑精的有效开发与利用。

国内外对于类黑精的提取做了大量研究。王明慧等[7]选用乙醇水溶液浸提法，确定了从糯米藕中提取类黑精的最佳工艺参数：乙醇体积分数10%，料液比1︰40（g/mL），浸提温度80 ℃，浸提时间1.5 h。秦礼康等[8]以陈窖豆豉为原料，通过不同体积分数乙醇为提取溶剂，确定了最佳提取条件：乙醇体积分数10%，料液比1︰3（g/mL），浸提24 h。张会娟等[9]采用乙醇丙酮分级沉淀、超滤、冷冻干燥的方法提取类黑精，研究表明分级提取时先乙醇提取后丙酮提取可提取出大部分类黑精。因此使用Box-Behnken响应面法优化提取工艺条件，通过连续变量建立曲面模型，对其影响因素交互作用进行分析，确定最佳水平范围。此次试验可行性强，试验组数相对较少，可有效节约资源[10-11]。通过响应面法确定出最佳的提取工艺条件，目的是进一步发掘黑参的可利用程度，为黑参的综合利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山新鲜人参（通化县崇参人参种植合作社）；无水乙醇、蒸馏水（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-50A立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司）；SQP电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；80-2离心机（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；FW-400A倾斜式万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑参的炮制工艺

炮制工艺是传统韩药材“九蒸九曝”的制作方法。首先选取4年生鲜人参，其大小适中，单支质量在40 g以上，无斑痕，无霉斑，清洗除杂，采用高温灭菌锅进行蒸制，并且固定蒸制温度110 ℃、蒸制时间2 h、干燥温度50 ℃、干燥时间12 h，此条件下进行9次循环[12]。将其粉碎过60目筛，适宜条件保存备用。

1.3.2 单因素试验

1) 确定最佳溶剂提取浓度：精确称取0.3 g黑参粉末，无损地转移到烧杯中，分别加入30 mL 0%，10%，20%，30%，40%和50%乙醇溶液，置于50 ℃水浴锅中120 min，以4 000 r/min离心15 min，取上层清液，测定其420 nm波长下的吸光度（由于A420与类黑精量呈正相关性，因此A420可反映出黑参中提取的类黑精含量[13]。）

2) 确定最佳料液比：精确称取30 mL 40%乙醇溶液，分别加入料液比为1︰10，1︰30，1︰50，1︰70，1︰90和1︰110（g/mL）黑参粉末，置于50 ℃水浴锅中120 min，以4 000 r/min离心15 min，取上层清液，测定其420 nm波长下的吸光度。类黑精量（AV值）=A420（吸光度）×V（相对体积比倍数）[14]，相对体积比倍数指料液比倍数。

3) 确定最佳水浴时间：精确称取0.43 g黑参样品，加入30 mL 40%乙醇水溶液，置于50 ℃水浴锅中，分别考察不同的水浴时间（0，30，60，90，120和150 min），以4 000 r/min离心15 min，取上层清液，测定其420 nm波长下的吸光度。

4) 确定最佳水浴温度：精确称取0.43 g黑参样品，加入30 mL 40%乙醇水溶液，分别考察不同的水浴温度（50，60，70，80，90和100 ℃），置于水浴锅中加热60 min，以4 000 r/min离心15 min，取上层清液，测定其420 nm波长下的吸光度。

1.3.3 黑参类黑精提取条件优化

根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对类黑精提取量的影响，选取对类黑精提取量影响较为显著的溶剂体积分数、水浴时间、水浴温度3个因素，以类黑精提取液的吸光度为响应值，建立三因素三水平的试验设计，确定最优提取工艺。响应面分析因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素和水平

1.3.4 提取率与提取级数的测定

在确定最佳提取条件下，多次浸提0.5 g黑参粉末，直至浸提液接近于无色，分别收集各次的浸提液吸光度Ai并测体积Vi（mL）与；最后合并各次提取液，得到总体积V（mL）与总吸光度A，计算各次的提取率，确定提取级数，提取率按式（1）计算[15]。

2 结果与分析

2.1 黑参中类黑精提取的单因素试验结果

2.1.1 溶剂体积分数对黑参中类黑精提取效果影响

随着乙醇体积分数的增大，黑参中类黑精的提取量呈现先增加后逐渐降低的趋势。当乙醇体积分数为40%时，提取量达到最大，A420为0.421，但此体积分数与乙醇体积分数20%和30%的溶剂提取效果无显著差异（p＞0.05）；当乙醇体积分数进一步增加至50%时，类黑精的提取量显著下降（p＜0.05）。适宜的乙醇体积分数有利于类黑精的提取，同时乙醇溶剂使类黑精的结构与功能更加稳定，还能使一些水溶性蛋白和杂质形成沉淀[16]，从而使类黑精的提取纯度更高。因此，选取40%的乙醇溶液。

图1 溶剂体积分数对黑参中类黑精提取效果影响

2.1.2 料液比对黑参中类黑精提取效果影响

随着料液比増加，黑参中类黑精提取量呈先增加后再下降的趋势。当料液比为1︰70（g/mL）时，提取类黑精的AV值为13.97，提取量达到最大，其中料液比1︰70，1︰50和1︰90（g/mL）的提取效果间无显著差异（p＞0.05）。当料液比大于1︰70（g/mL）时，类黑精的提取量下降。在一定范围内增加提取溶剂量影响固相主体与液相主体之间的浓度差，有助于提高溶剂扩散率和传质速率，但溶剂量过大会导致浸出的类黑精对未浸出产物有一定抑制作用，且提取完全所需时间相应延长[17-18]。因此，选取料液比1︰70（g/mL），但料液比因素对类黑精的提取量影响并不显著（p＞0.05），因此不作为响应面考虑因素。

图2 料液比对黑参中类黑精提取效果影响

2.1.3 水浴时间对黑参中类黑精提取效果影响

随着水浴时间的增加，类黑精的提取量呈现先增加后趋于稳定的趋势。在水浴时间60 min内，类黑精提取量显著増加（p＜0.05），60 min时达到最大提取量，A420为0.37；当水浴时间为60～150 min时，类黑精提取量较为恒定，提取量无显著性差异（p＞0.05）；说明在水浴提取60 min时，黑参中类黑素的提取较为完全，水浴时间的延长并不能提高类黑精的浸提效果，也可能由于溶剂挥发导致乙醇体积分数降低，浸提效果并未增强[19]。因此，提取黑参中类黑精时的水浴时间为60 min。

图3 水浴时间对黑参中类黑素提取效果影响

2.1.4 水浴温度对黑参中类黑精提取效果影响

随着提取温度的升高，黑参中类黑精提取量显著增加（p＜0.05），当水浴温度达到80 ℃时，黑参中类黑精的提取量达到最大值，A420为0.455。当水浴温度高于80 ℃时，提取量较为恒定，且无显著差异性（p＞0.05）。当水浴温度的升高时，类黑精分子运动的速度加快，有利于黑参中类黑精的溶解和释放。但水浴温度超过80 ℃时，可能乙醇溶剂的挥发和类黑精溶解程度较为完全，因此提取量并未得到较大提升。同时，温度持续升高还可能破坏其结构功能[20-21]。

图4 水浴温度对黑参中类黑素提取效果影响

2.2 黑参中类黑精提取的的响应面优化试验结果

2.2.1 响应模型的建立与分析

在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对黑参中类黑精提取效果的影响，依据Box-Behnken试验设计原理，通过响应面法对溶剂体积分数、水浴温度、水浴时间3个因素分析得到试验方案和结果。对表2中的数据进行多元回归拟合，获得黑参中类黑精对编码自变量溶剂体积分数、水浴温度、水浴时间的二次多项回归方程：类黑精提取液吸光度=+0.47-7.375E-003A-2.125E-003B+0.015C+4.750E-003AB-1.000E-003AC-0.011BC-0.038A2-0.030B2-0.023C2。

表2 响应面分析方案与结果

从表3可以看出，在黑参提取过程中整体模型的F=574.00，模型回归值p＜0.000 1，表明回归模型极显著，其中一次项A、C、AB、BC和二次项A2、B2、C2均表现出极显著水平，一次项B表现出显著水平。由溶剂体积分数（A）、水浴时间（B）、水浴温度（C）的F值可知，各影响因素的主次顺序为水浴温度（C）＞溶剂体积分数（A）＞水浴时间（B）。失拟项是用来表示模型与试验拟合程度，也就是二者的差异程度。同时，失拟项F=2.99，p=0.158 8，失拟项不显著，表明该模型对试验有着良好的一致性[22]，模型中调整系数R2Adj=99.69%，说明99.69%响应值的变化可以通过该模型解释，相关系数R2=99.86%，表明模型与试验有很好的拟合度，此模型可以分析与预测黑参中类黑精的提取量，有较高的可信度。

表3 回归方程方差分析

2.2.2 提取黑参中类黑精的响应面分析

图5 各因素交互作用对黑参中类黑精提取效果的影响

为进一步分析溶剂体积分数、水浴温度、水浴时间对其类黑精的提取率的影响，将其中任一因素固定为0水平，可得到另外两个因素交互作用的响应面图和等高线，如图5所示。从响应面图和等高线可直观地看出溶剂体积分数、水浴时间和水浴温度间的交互作用可反映出因素对其黑参中类黑精提取率的影响。等高线形状和响应面曲面坡度可以反映自变量交互效应的强度。等高线形状若趋向于椭圆形，则两自变量之间交互作用明显；等高线密度大，表明因素间交互作用较强；响应面图曲率越大，即坡度越陡，说明因素间交互作用越显著[23]。由此分析可知，水浴时间与水浴温度、溶剂体积分数与水浴时间之间的交互作用对其类黑精的提取率影响极显著，溶剂体积分数与水浴温度的交互作用对其响应值影响不显著，这与表3回归方程方差分析结果一致。

2.2.3 确定最佳提取条件与验证回归模型

通过响应面法得到黑参中类黑精最佳提取工艺参数：乙醇体积分数39%、料液比1︰70（g/mL）、水浴时间57 min、水浴温度84 ℃。此工艺条件下黑参中类黑精提取液理论吸光度为0.472，按此工艺参数进行试验验证，得到类黑精吸光度平均值为0.467，其相对误差约为1.06%，说明回归方程模型比较可靠，具有一定的实践指导意义。

2.3 提取级数的确定

通过上述试验，在黑参中类黑精最佳提取工艺的条件下，分级多次浸提黑参粉末样品，通过1.2.4中方法计算黑参中类黑精在不同级数的提取率。如表4所示，随着黑参中类黑精提取级数的增加，提取液中类黑精的提取量也在增大，经2次提取类黑精的提取率已经达到93.2%，提取较为完全，因此对于黑参中类黑精的最佳提取级数为2级。

表4 提取级数对提取效果影响

3 结论

试验以九蒸九曝方式加工成的黑参为原料，通过响应面法优化了黑参中类黑精提取工艺，黑参中类黑精的最佳提取工艺为溶剂体积分数39%乙醇溶液、料液比1︰70（g/mL）、水浴时间57 min、水浴温度84℃，在最佳工艺的条件下测得类黑精提取液吸光度为0.467，与预测值基本一致，最佳提取级数为2级，提取率为93.2%。此次试验进一步发掘了黑参的可利用程度，为黑参的综合利用提供技术依据。