分光光度法测定葡萄糖含量的研究

师改琴，李心怡，孙雅琪，靳文涛，王随锟，李茹，梁振海

（太原理工大学现代科技学院，山西 孝义 032300）

葡萄糖是一种产量大、应用广、价格便宜易得的醛基糖，也是一种最常见的单糖。由于天然葡萄糖水溶液旋光向右，故属于 “右旋糖”[1-2]。葡萄糖用途很广泛，广泛的应用在医学、食品和工业制造等行业中。在医学方面，葡萄糖主要作为营养剂（葡萄糖注射液）运用在临床上。还可以用于葡萄糖盐水口服液、葡萄糖酸盐、维生素C等药品的生产中[3]。在食品工业方面，葡萄糖是食品中的重要营养成分，广泛存在于初级食品和加工食品中，可以经异构酶处理后制造果糖，尤其是含42%果糖的果葡糖浆，已成为当前制糖工业的重要产品[4]。在工业方面，葡萄糖可以在印染制革工业中作还原剂，在制镜工业和热水瓶胆镀银工艺中常用葡萄糖作还原剂[5]。葡萄糖作为人体中枢神经系统血糖能源的来源，其含量过多或过少均会引起糖尿病、肾病、视网膜和神经系统的并发症等病症[6-9]。因此，建立快速、便捷的葡萄糖测定方法对医用化学和食品分析有着十分重要的意义。

目前对葡萄糖含量的测定方法常用的有滴定分析法[10]、碘量法[11]、高效液相色谱法[12]、酶电极法[13]、旋光法[14]、比色法[15-16]。滴定分析法适用于常量组分的测定，系统误差较大。高效液相色谱法检测结果准确度高，但对仪器及实验条件的要求也高。酶电极法成本较高，不适合实验室用。旋光法操作简单快捷，但在实验过程中，存在很多不稳定因素影响测量结果的准确率。比如在量取、稀释、热压灭菌过程中容易使葡萄糖分解，导致测量的葡萄糖含量的误差偏大。比色法操作简单快捷、准确率高，仪器简单，仅需要一台分光光度计。本文采用DNS试剂（3，5-二硝基水杨酸试剂）和分光光度计测量并计算出未知溶液中葡萄糖的含量，准确度高。为后续的葡萄糖转化率的计算提供了一种方法。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

主要试剂与仪器见表1。

表1 实验试剂和仪器

1.2 实验过程

1）配制溶液。显色剂的配制：称取3，5-二硝基水杨酸6.5 g，加入少量的水使其溶解，然后定量转移到1000mL的棕色容量瓶中；称取80 g的氢氧化钠，溶解后配制成2 mo1／L的氢氧化钠溶液，量取325 mL转移到装有3，5-二硝基水杨酸的棕色容量瓶中，再向其中加入称取好的丙三醇46.24 g，摇匀后放置冷却，冷却后用蒸馏水定容到刻度线，摇匀。

系列标准溶液的配制：

将葡萄糖于烘箱中105℃下2h烘干，然后放在干燥器中保存备用。称取上述烘好的葡萄糖10 g，然后加少量的水溶解后转移至1000 mL的容量瓶中，稀释定容配制成标准溶液。取7个干燥的100 mL的容量瓶，分别移入0、10、20、30、40、50、60 mL，稀释定容，即配得浓度分别为 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg／mL的系列葡萄糖标准溶液。

2）测量波长的选择。用吸量管吸取0.0、2 mL的上述配好的浓度为3.0 mg／mL葡萄糖标准溶液分别加入两个25 mL的容量瓶中，再分别加入2 mL的3，5-二硝基水杨酸溶液，蒸馏水稀释至刻度线，摇匀放置。分别取2 mL的上述溶液在中沸水浴加热2min，自然冷却。以未加入葡萄糖标准溶液的试剂为参比溶液，在440～560 nm，每隔20 nm测一次吸光度。图1为吸光度与波长关系的吸收曲线。由图1看出，最大吸收波长为510 nm，但分光光度计最佳测量值吸收范围为0.2～0.8 A[16]，所以最终确定相对最大吸收波长540 nm。

图1 吸收光谱图

3）DNS显色试剂用量的确定。比色分析方法中，常常需要加入稍过量的显色剂。但显色剂如果加入太多，容易引起副反应。取六个25 mL的容量瓶分别加入1 mL不同浓度的葡萄糖标液，分别加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的 DNS试剂，沸水浴反应2min，自然冷却，蒸馏水定容至刻度线，以相同条件下不加葡萄糖的溶液作空白对照，在540 nm下测定吸光度值。图2为DNS显色剂用量与吸光度的关系曲线。由图2看出，DNS显色试剂用量在0.5～1.5 mL时，吸光度值随DNS试剂的用量增大而增大，DNS试剂用量超过1.5 mL时，DNS用量继续增大，吸光度值处于平缓状态。所以，选择DNS试剂用量为1.5 mL。

图2 显色试剂用量对吸光度的影响

4）显色时间的确定。取5份3.0 mg／mL的葡萄糖标液1 mL，分别加入1.5 mL的DNS试剂。沸水浴中分别加热1、2、3、4、5、6、7 min，自然冷却后在540 nm下测定吸光度值。图3为显色时间与吸光度的关系曲线。

图3 反应时间对吸光度的影响

由图3看出，反应时间在1～2min内反应产物的吸光度值随着反应时间的增加而呈上升趋势，反应时间超过2min后产物吸光度值不再随着反应时间的增加而增大，处于平缓状态。所以，反应时间最佳为2min。

5）反应温度的确定。取5份3.0 mg／mL的葡萄糖标液1 mL，分别加入1.5 mL的DNS试剂。分别在温度为70、80、90、100、110℃沸水浴中加热2 min，自然冷却后在540 nm下测定吸光度值。图4为反应温度与吸光度的关系曲线。由图4看出，反应产物的吸光度值随着温度的增加而呈上升的趋势，当反应温度超过100℃后，产物吸光度值不再随着反应温度的增加而增大，处于平缓状态。所以，反应温度最佳为100℃。

图4 反应温度对吸光度的影响

6）葡萄糖标准工作曲线的绘制。分别移取一定梯度的葡萄糖系列标准溶液在上述最优条件下测其吸光度做标准曲线。图5为标准曲线。

7）标准曲线回归方程的绘制。由图5看出，葡萄糖质量浓度在1～8 mg／mL范围内与DNS试剂反应后反应液的吸光度值与葡萄糖浓度之间呈良好的线性关系。

8）标准曲线法测定未知溶液中葡萄糖的含量。未知溶液：前期的葡萄糖双极电化学反应后阴阳两极产物。运用该方法可以计算葡萄糖的转化率。将电解液的浓度稀释到上述标准曲线中葡萄糖的浓度范围内，在上述测得的最佳条件下测其吸光度，然后在标准工作曲线上找出对应的葡萄糖的浓度。再根据当初稀释的倍数计算出电解液中葡萄糖的真实浓度。

9）重复性试验。用质量浓度为3.0 mg／mL的葡萄糖标液与DNS试剂在上述测得的最佳条件下反应，在波长540 nm处连续测定6次吸光度，测定结果见表2。由表2看出，同一质量浓度的葡萄糖溶液与显色剂DNS的反应液在波长540 nm处测定的吸光度值标准偏差很小，说明该方法重复性好，准确率高。

图5 DNS法测定萄糖含量标准曲线

表2 重复性实验测量结果

取稀释后的未知溶液加入DNS显色剂后在上述条件下连续6次测其吸光度，结果看出测得的吸光度值标准偏差很小，说明该方法重复性好，准确率高，可以运用在计算葡萄糖转化率的应用中。

2 结果与讨论

经实验确定的 DNS法测定葡萄糖含量的最佳波长为540 nm，DNS显色试剂用量为1.5 mL，显色时间最佳为5min。精密度试验表明该方法的准确率高，运用该方法测得未知溶液中葡萄糖的浓度，为葡萄糖电解反应提供了计算葡萄糖转化率可行的方法。