高温漆酶产生菌Bacillus thuringiensis strain Lac-72的筛选、鉴定及其酶学性质研究

李雪英,王建蝶,黄毕生,廖少华,陈贵元

1.大理大学农学与生物科学学院,云南 大理 671003

2.大理大学基础医学院,云南 大理 671000

3.云南省昆虫生物医药研发重点实验室,云南 大理 671000

漆酶（Laccase）是一种多酚氧化酶，广泛存在植物、真菌和细菌中[1]。漆酶可利用分子氧作为电子受体，从而氧化多种酚类化合物，并将分子氧还原，生成水[2]。目前，对染料废水的处理有传统的物理、化学处理法和生物处理法[2]。由于染料废水色度高、成分复杂、有机污染物含量高、进入环境后难以降解，传统的物理和化学方法效率低、成本高、能耗大，而且还可能造成二次污染。而生物法处理染料废水，具有去除率高、费用低、环境友好等特点。因此，近年来漆酶成为了处理染料废水最具应用潜力的生物酶。由于漆酶不但能脱除染料废水的颜色，还能降解木质素，能够去除许多酚类物质的毒性，由于漆酶的这些酶学特性，使得漆酶被广泛应用到食品加工[3]、环境污染治理[4]和造纸[5]等多个工业领域。

目前应用于染料废水脱色的漆酶多来源于担子菌、子囊菌等真菌，尤以白腐真菌最为主。赵美丽[6]筛选到一株高产漆酶的白腐真菌，该菌株所产的漆酶在脱色氧化降解靛蓝和金橙的研究中，发现该漆酶最适pH 为5.0，最佳温度是30ºC，用3.9 U·mL-1的漆酶来进行脱色降解反应时，420 min时脱色较完全。曾祥康[7]筛选到一株产漆酶的真菌Trametes trogii SYBC-LZ，在研究该菌株漆酶酶活时发现：Trametes trogii SYBC-LZ 漆酶要在偏酸性的条件才能具有高酶活。由于真菌漆酶最适pH 一般偏酸，这严重限制了漆酶在工业中的应用[8]。因为有色废水的成分一般比较复杂，pH 变化范围较大。与真菌漆酶相比，细菌漆酶[9]在热稳定性、酶促反应pH 范围广等方面比真菌漆酶更有优势，而且细菌本身具有生长代时短、易培养等优势，因此筛选出具有漆酶活性的细菌，对其性质进行研究具有重要的意义。鉴于此，本研究从云南省大理州洱源县牛街镇一热泉中分离到一株产漆酶细菌，对该细菌漆酶酶学性质进行了研究，为漆酶工业化生产及应用提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品 大理洱源县牛街镇热泉的底泥，热泉水温72ºC。

1.1.2 试验仪器BT224S 型电子天平（Sartorius），722E 型光分光光度仪（上海菁华仪器公司），CX31型显微镜（Olympus Corporation），THZ-82 恒温水浴摇床（常州智博瑞仪器制造有限公司），立式压力蒸汽来菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），洁净工作台（苏州净化设备有限公司），DL-8000C 低速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），低温培养箱（上海一恒科学仪器公司），PCR仪（美国ABI 公司），DYY-7C 型电泳仪（北京六一仪器厂）。

1.1.3 试剂 酵母提取物（OXOID）、蛋白胨（OXOID）；牛肉膏、琼脂粉、七水硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、结晶紫、葡萄糖、番红、乙醇、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、愈创木酚等试剂均为国产分析纯。基因组DNA 提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购于北京天根生物技术公司。

1.1.4 培养基（1）富集培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、CuSO4·5H2O 0.032 g，定容至1000 mL，121ºC 灭菌20 min；（2）愈创木酚PDA 培养基：马铃薯200 g·L-1（煮沸30 min取滤液）、葡萄糖10 g·L-1、琼脂20 g·L-1，pH 自然，121ºC 灭菌20 min，灭菌后加入0.2 mL 愈创木酚；（3）LB 斜面培养基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、琼脂20.0 g、pH 7.2～7.4，121ºC 灭菌20 min；（4）发酵基础培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、K2HPO4·3H2O 1.5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g，pH 7.0，定容至1000 mL，121ºC 灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 产漆酶细菌的初筛 将2 g 牛街镇热泉底泥加入到50 mL 的富集培养基中，混匀，72ºC、150 r·min-1振荡培养24 h；将培养液梯度稀释10-1至10-7后，涂布于愈创木酚PDA 培养基平板上，37ºC培养4 d。挑取有明显水解圈的菌落经多次划线分离纯化，并保存于LB 斜面培养基，4ºC 冰箱保存。

1.2.2 产漆酶细菌的复筛 用接种环挑取适量初筛得到的菌株接入发酵基础培养基（装液量50 mL/250 mL）中，72ºC、160 r·min-1摇床恒温培养5 d，将培养好的发酵液于6000 r·min-1离心10 min，上清液即为粗酶液，测定其酶活力，以活力高低作为复筛的依据。

酶活测定原理[10]：漆酶能催化ABTS 生成稳定的ABTS 阳离子自由基，ABTS 阳离子自由基水溶液呈浅蓝色，在420 nm 波长处有特性吸收。根据吸光度值随催化时间的变化关系计算漆酶酶活。

酶活定义：在75ºC 下，以每分钟氧化1 μmol 的ABTS 所需要的酶量定义为1 个酶活力单位，酶活性以U·mL-1表示。参照文献[11]的方法，稍作改动测定酶活，计算公式如下：

式中：ΔOD为t时间内吸光度变化值；N为酶液稀释倍数；V总为漆酶酶活测定反应体系总体积，mL；ε为ABTS 在420 nm 处的摩尔消光系数，为3.6×104mL·mmol-1·cm-1；t为反应时间，min；V酶为反应添加的酶液体积，mL；l为比色皿的直径，1 cm；103表示mmol·L-1转换为μmol·L-1的系数。

1.2.3 菌种鉴定（1）显微形态及生理生化特征分析，参照文献[12,13]的方法开展形态学观察及细菌生理生化实验；（2）分子生物学鉴定：依据DNA 提取试剂盒的方法提取细菌基因组DNA。采用通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，扩增细菌16 S rRNA 序列。PCR 试验条件：94ºC，预变性5 min；94ºC，变性30 s，50ºC 退火，45 s，72ºC 延伸，100 s，循环30 次；72ºC 延伸，5 min。PCR 产物经0.8%的琼脂糖凝胶140 V，电泳1 h，按胶回收试剂盒说明书回收PCR 产物。将胶回收产物送上海生工生物技术公司测序，将获得的碱基序列提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库，采用在线软件BLAST 进行碱基序列比对分析，利用MEGA 5.0 软件构建系统进化树。

1.2.4 菌株最适生长温度 按接种量为1%，将菌种接于LB 液体培养基中，置于不同的温度下摇床培养48 h，然后在波长600 nm 处测定各个温度下菌株生长的吸光值，并测定相应培养温度下发酵上清液的酶活，确定菌株的最适发酵温度。

1.2.5 漆酶酶学性质的研究（1）最适反应温度测定：参照文献[10,14]的方法，本研究中漆酶酶促反应的时间均定为3 min。根据酶活测定方法，分别测定4ºC、25ºC、37ºC、45ºC、55ºC、60ºC、65ºC、75ºC、80ºC、85ºC，10 个不同温度下，酶促反应3 min 后的酶活，以等体积的蒸馏水代替酶液为空白对照，将各温度下测得的吸光度值之差代入公式(1)，计算酶活；（2）酶的热稳定性：缓冲液同上，测酶活反应体系同上，在最适pH 下，分别取350 μL 粗酶液分装于7 个EP 管中，置于4ºC、25ºC、37ºC、55ºC、75ºC，5 个温度下，每隔15 min，从各管中吸取50 μL 酶液，用pH 为6.0，0.15 mol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释到3 mL。在冰浴条件下迅速向各管中加入29.5 μL，0.5 mmol·L-1的ABTS 底物，充分混匀。以同体积的蒸馏水代替酶液。测定其各个温度条件下剩余的酶活，以保温前的酶活为参照，采用相对酶活绘制酶的热稳定曲线；（3）最佳pH 的测定：配制不同pH 值（4～10）的缓冲液，在最适反应温度下测定不同pH 值对酶活力的影响，以等体积的蒸馏水代替酶液为空白对照，反应3 min 后测定酶活；（4）金属离子对酶活的影响：金属离子对酶有激活或者抑制的作用。取7 mL 粗酶液，平均分装到7 个EP 管中，每个EP 管中有酶液1 mL，取出一个EP 管作为对照，在剩下的6 个EP 管中分别加入10 μL 不同的金属离子（K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+），使金属离子的终浓度为1 mmol·L-1，4ºC 放置过夜。向每个EP 管中加入pH 为6.0，浓度为0.15 mol·L-1的乙酸-乙酸钠缓冲液至3 mL，在冰浴条件下迅速向每管中加入29.5 μL，0.5 mmol·L-1的ABTS 底物，充分混匀。测定各EP 管中漆酶的酶活，设定对照管的酶活为100%，其余各EP 中漆酶的酶活与对照管的酶活相比，用相对酶活表示金属离子对酶活的影响。

1.2.6 漆酶对染料废水的脱色（1）对孔雀石绿废水的脱色作用：配制初始浓度为20 mg·L-1孔雀石绿模拟废水，在波长618 nm 处测定漆酶对孔雀石绿催化脱色前后的吸光度值[15]。根据OD618的变化计算漆酶对孔雀石绿模拟废水的脱色作用。反应总体积为4 mL，其中20 mg·L-1孔雀石绿溶液500 μL，pH 为6.0 的柠檬酸缓冲液3 mL，500 μL 粗酶液。以蒸馏水代替孔雀石绿溶液作为空白对照，在酶的最适温度下测定漆酶对孔雀石绿染料的脱色作用，计算脱色率:

式中：ODt为反应t时刻的吸光度值；OD0为初始时刻的吸光度值。（2）结晶紫废水的脱色作用：参照文献[15]配制初始浓度为20 mg·L-1结晶紫模拟废水，在波长557 nm 处测定漆酶催化结晶紫废水脱色前后的吸光度值，根据OD557值的变化计算漆酶对结晶紫的脱色效率。反应体系、检测方法、脱色率计算等方法同孔雀绿模拟废水脱色方法。

2 结果与分析

2.1 漆酶高产菌株的筛选

经含铜培养基富集，培养液梯度稀释10-1至10-7后，涂布于愈创木酚PDA 固体培养基平板上，25ºC 培养48 h 后。可从平板上筛选到一株产漆酶的菌株，命名为Lac-72。在愈创木酚PDA 培养基平板上，Lac-72 菌落呈白色、圆形、不透明、且表面光滑湿润有光泽（图1）。

图1 Lac-72 菌落形态Fig.1 Colony morphology of Lac-72

2.2 菌株Lac-72 的鉴定

2.2.1 形态学、生理生化特征 通过革兰氏染色，芽孢染色观察，Lac-72 为革兰氏阳性杆菌，产中心芽孢（图2，3）。

图2 Lac-72 的革兰氏染色（100×）Fig.2 The gram staining of Lac-72(100×)

图3 Lac-72 的芽孢染色（100×）Fig.3 The spore dyeing of Lac-72(100×)

对Lac-72 的生理生化特性进行研究，发现V-P 实验、甲基红实验、吲哚实验、明胶实验结果均为阳性；乳糖发酵实验结果为阴性；葡萄糖发酵实验、蔗糖发酵实验结果均为能利用糖，但不产气。

2.2.2 16 S rRNA 基因序列及系统发育分析 细菌基因组DNA 经PCR 扩增，产物经电泳分析如图4 所示。将DNA 进行胶回收，并送生物技术公司测序，得到Lac-72 16 S rRNA 基因的PCR 扩增产物片段长度为1457 bp。将16 S rRNA 基因序列与GenBank 数据库中的序列进行同源性比对，发现Lac-72与苏云金芽孢杆菌属（Bacillus thuringiensis）的16 S rRNA 基因序列自然聚类。从数据库中选出17株与Lac-72 的16 S rRNA 基因序列同源性达98%的基因序列，构建系统发育树如图5 所示。从图中可以看出Lac-72 与Bacillus thuringiensis strain Ou2（KP125698.1）聚为一簇，相似性也最高，为99.5%，表明Lac-72 与Bacillus thuringiensis的亲缘关系最近。

图4 Lac-7216SrRNA 基因PCR 扩增产物电泳检测Fig.4 Electrophoresis of PCR amplified product of Lac-7216 S rRNA

图5 基于16SrRNA 基因序列相似性的菌株Lac-72 与17 株细菌的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of strain Lac-72 and 17 bacterial strainson sequence similarity of 16S rRNA

根据Lac-72 的形态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》[16]，以及Lac-72 16 S rRNA基因序列及系统发育树，将其初步鉴定为芽孢杆菌属的一株菌，命名为Bacillus thuringiensisLac-72。

2.3 菌株的最适发酵温度

按照实验方法，在波长600 nm 处测定不同温度培养下LB 培养基的吸光度值，以600 nm 处的吸光值为纵坐标，温度为横坐标，绘制生长曲线，结果如图6 所示。

从图6 中可以知，30～55ºC 范围，菌体的生长量随着温度的升高而增加，55ºC 时，LB 培养基在600 nm 下的吸光值最高，表明55ºC 是菌株的最适生长温度。55ºC 以后，菌体生长量随着温度的升高而下降，菌株在75ºC 下菌体还有一定生长，表明菌株Lac-72 属于典型的耐高温菌，其最适产酶温度也是55ºC。

图6 Lac-72 的生长及产酶温度优化Fig.6 Growth and enzyme-producing optimization of Lac-72

图7 温度对Lac-72 漆酶活性的影响Fig.7 Effect of temperatures on Lac-72 laccase activity

2.4 漆酶酶学性质研究

2.4.1 温度对漆酶活性的影响 根据实验方法，在不同温度下测定酶的活性（图7）。

从图7 可以看出，该菌株的最适温度为75ºC，当温度为4ºC 时，仍有活性。在4～75ºC，随着温度升高，酶活力增加，在75ºC 时，酶活力达到最大值，达到56.22 U·mL-1，当温度超过75ºC，酶活开始急剧下降，结果表明Lac-72 所产漆酶属于高温酶。

2.4.2 酶的热稳定性 采用ABTS 作为底物，测定其各个温度，不同时间条件下剩余的酶活，以保温前的那个温度下所测得的酶活为参照，其余温度下所测得酶活与其相比，用相对酶活绘制出酶的热稳定性曲线（图8）。该漆酶在4ºC 及25ºC 下保温酶能够在长时间保持相对稳定的酶活，该酶可在较低的温度下保存。酶在75ºC 保温75 min，仍能保持25%的酶活，表明该漆酶是典型的高温酶。

图8 Lac-72 漆酶的热稳定性Fig.8 Thermal stability of Lac-72 laccase

图9 pH 对Lac-72 漆酶活性的影响Fig.9 Effects of pH on the activity of Lac-72 laccase

2.4.3 酶的最适反应pH 根据实验方法，在不同的pH 条件下分别测定酶活，结果如图9 所示。

从图9 可以看出，pH8.0 之前，漆酶活力随着pH 值的升高而升高，在超后pH8.0，酶活力下降，表明Lac-72 漆酶的最适反应pH 值为8.0，属于碱性漆酶。在pH4～10 范围内均有活性，在后续的实验中，选择pH 8.0 作为漆酶的最适反应pH。

2.4.4 金属离子对酶活的影响 将含各种金属离子的酶液在4ºC 中保温过夜后，测酶活反应体系同上，在最适温度和最适pH 下测定各种金属离子对酶活力的影响结果，以对照酶活为100%，添加金属离子的酶液酶活与其相比，求出相对酶活。结果如表1 所示。

表1 金属离子对Lac-72 漆酶活性的影响Table 1 Effect of metal ions on laccase activity of Lac-72

从表1 可以看出，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+4 种金属离子对酶有具有激活作用，其中Cu2+激活作用最强。K+、Mn2+、Zn2+对酶有一定的一直抑制作用，其中K+对酶具有较强的抑制作用。

2.5 漆酶对染料废水的脱色研究

为了测试菌株Lac-72 漆酶对染料的脱色能力，选择了2 种三苯甲烷类染料（孔雀绿、结晶紫）配成模拟废水进行脱色实验。结果表明菌株Lac-72 漆酶对孔雀石绿和结晶紫模拟废水均具有较好的脱色效果。在漆酶最适反应条件下，对孔雀石绿和结晶紫模拟废水分别脱色60 min，孔雀石绿和结晶紫的脱色率可分别达到85%和72%（图10）。

图10 Lac-72 漆酶对孔雀石绿和结晶紫染料废水的脱色作用Fig.10 Decolorization of malachite green and crystal violet dye wastewater by Lac-72 laccase

3 讨论

目前，对漆酶的研究及应用主要集中于真菌漆酶，而细菌漆酶的研究相对较晚。Givaudan 于1993年首次从水稻根际土壤中分离到脂固氮螺菌漆酶[17],标志着细菌漆酶的开始。通常，真菌漆酶的最适酶活反应pH 范围为4～6，最适作用温度为30～50ºC[18]，这一特性限制了真菌漆酶的生产应用。而细菌漆酶反应pH 多为碱性，且范围宽，耐热性较真菌漆酶要好。在工业生产中，耐热酶具有诸多优势：（1）提高酶促反应速率，提高催化效率；（2）工业生产中，能降低系统冷却要求，减少能耗；（3）可通过热处理简化酶的提纯，降低制备酶的成本；（4）使酶便于运输和储藏。因此，广泛开展细菌漆酶，特别是嗜热细菌漆酶的研究具有重要意义。

嗜热细菌（Thermophilic bacteria）通常指能在55ºC 以上生长的细菌，主要分布于火山口、堆肥、温泉和工厂废水排放口附近。嗜热细菌所产的酶往往具有极强的耐热性，在工业生产中具有巨大的应用价值[19]。目前，已报道产漆酶的极端嗜热细菌主要有嗜热栖热菌（Thermus Thermophilus）、超嗜热菌（Aquifex aeolicus）和耐超高温热棒菌（Pyrobaculum aerophilum）[20]。本研究从云南省大理州洱源县牛街镇72ºC 地热温泉底泥中筛选到1 株产漆酶的高温菌，初步鉴定为苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis），命名为Bacillus thuringiensisstrain Lac-72。Lac-72 最适生长温度为55ºC，在75ºC 仍能生长，是典型的嗜热细菌，该菌所产漆酶最适酶活温度为75ºC，热稳定性较好，75ºC 保温75 min，仍能保持25%的酶活，表明该漆酶是典型的高温酶，与Fernandes 等人报道的嗜热漆酶Mco A 具有相似的酶学特性[21]。由于染料废水成分复杂、色度高、pH 变化范围较广，真菌漆酶最适pH 一般偏酸性，而本实验筛选到的细菌漆酶最适反应pH 值为8.0，在pH4～10 范围内均有活性，表明该菌株所产漆酶可以直接用于处理工业染料废水。

金属离子耐受实验表明，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+，4 种金属离子对该酶具有激活作用，其中Cu2+激活作用最强。王习文等[22]认为Cu2+可能是通过改变漆酶的结构或者酶蛋白分子的电荷分布来影响酶的活性，在pH 大于4.5 时，Cu2+表现出对漆酶的活化作用。本研究结果表明，在pH 为8.0 的反应体系中，Cu2+对漆酶有激活作用，这一结果与已报道的结果相一致[22]。K+、Mn2+、Zn2+对该酶均有抑制作用，其中Mn2+、Zn2+对该酶酶活有轻微的抑制作用，而K+对酶活的抑制作用最为显著，可能是因为这几种金属离子诱使酶的活性中心结构改变，使酶与底物的结合能力减弱，从而抑制了酶活。上述结果表明，该漆酶在大多数金属离子存在下均展现出较好的催化活性，表明该漆酶在处理含有金属离子的染料废水方面具有潜在的应用价值。

三苯甲烷类染料不是漆酶的特异底物[23]，但本研究筛选到的菌株Lac-72 所产漆酶对孔雀石绿和结晶紫废水均有很好的脱色效率，表明该菌株所产的漆酶在环境污染治理方面具有潜在的应用价值。

4 结论

从云南省大理州洱源县牛街镇72ºC 地热温泉底泥中筛选得到一株产漆酶细菌，初步鉴定为芽孢杆菌属的一株菌，命名为Bacillus thuringiensisLac-72。该菌株所产漆酶的最适作用温度为75ºC，最适酶活pH 值为8.0。在25ºC 以下，能保持良好的稳定性。K+、Mn2+、Zn2+对该酶有一定抑制作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均对该酶活力起到促进作用，其中Cu2+的促进效果最为明显。该酶对三苯甲烷类染料孔雀石绿和结晶紫废水进行脱色处理60 min，脱色率分别可达85%和72%。本研究可为细菌漆酶的开发应用提供实验基础。