长链非编码RNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相关肝癌组织中的表达及其临床意义

（绍兴第二医院 感染性疾病科，浙江 绍兴 312000）

原发性肝癌为常见恶性肿瘤之一，其预后差，发病率和病死率较高。乙型肝炎病毒感染是我国主要的肝炎感染类型，乙型肝炎病毒感染是原发性肝癌的独立危险因素和主要病因；在肝癌患者中，乙型肝炎病毒感染占全肝癌病因的70%[1]。随着医疗水平的进步，肝癌的诊疗方法不断趋于成熟，但其术后5年复发率仍较高，预后较差，缺乏有效的监测靶点和有效的诊疗是肝癌预后差的主要原因。长链非编码RNA（lncRNA）具有多种生物学功能，近年来研究发现多种lncRNA 参与癌基因或抑癌基因恶性肿瘤的发生、发展[2-3]。lncRNA CCHE1 在宫颈癌、甲状腺癌等恶性肿瘤中表达升高，与甲状腺癌等恶性肿瘤的临床分期、淋巴结转移关系密切，可作为甲状腺癌诊断和预后评估的潜在标志物[4-5]。有研究发现lncRNA CCHE1 在肝细胞癌组织和细胞中呈高表达，具有促进肝细胞癌细胞增殖，抑制肝细胞癌凋亡的作用[6]。笔者对lncRNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相关肝癌组织中的表达及在乙型肝炎病毒感染相关肝癌诊断、病情判断及预后评估中的价值进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2012年1月—2014年12月绍兴第二医院收治的94 例乙型肝炎病毒感染相关肝癌患者的肝癌组织及其癌旁组织。其中，男性67 例、女性27 例；平均年龄（53.64±7.14）岁；酗酒50 例；平均肿瘤直径（5.13±1.06）cm；门静脉癌栓25 例，淋巴结转移18 例。癌旁组织取自肝癌组织外缘3 cm 外的肝组织。纳入标准：①患者进行手术治疗，均经乙型肝炎病毒感染相关指标及术后病理检查证实为乙型肝炎病毒感染相关肝癌（其对应选取的癌旁组织经病理证实为健康肝组织）；②术前未进行放、化疗等其他治疗；③酗酒患者饮酒规律，男性平均酒精摄入量＞60 g/d，女性平均酒精摄入量＞40 g/d[7]。排除标准：①甲、丙、丁及戊型肝炎病毒相关肝癌患者；②继发性肝癌患者；③其他恶性肿瘤患者；④糖尿病、高血压等其他疾病者；⑤失访者；⑥随访资料不完整者。本研究经医院伦理委员会审批后进行。

1.2 方法

采用RT-PCR 测定肝癌组织和癌旁组织中lncRNA CCHE1 的表达。将肝癌组织及癌旁组织碾碎，加入Trizol 提取总RNA（Trizol 试剂盒购自美国Sigma公司），将总RNA 逆转录为cDNA（逆转录试剂盒购自美国ABI 公司），进行PCR 扩增，反应条件：94℃预变性10 min，94℃变性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共42 个循环。以GAPDH 为内参。lncRNA CCHE1 相对表达量以2-ΔΔCt法计算。CCHE1 引物正向引物：5'-AAGGTCCCAGGATACTCGC-3'，反向引物：5'-GTGTCGTGGACTGGCAAAAT-3'，长度24 bp。所有患者采取门诊和电话随访，随访开始时间为手术结束当日，随访结束日期为2019年12月31日或死亡日。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；绘制ROC 曲线，Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织和癌旁组织中lncRNA CCHE1 相对表达量比较

肝癌组织中lncRNA CCHE1 相对表达量为（1.57±0.10），癌旁组织为（1.00±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=41.077，P=0.000），肝癌组织较癌旁组织高。

2.2 不同临床病理特征患者肝癌组织中lncRNA CCHE1 相对表达量比较

不同年龄、性别、酗酒患者肝癌组织中lncRNA CCHE1 相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。不同肿瘤直径、TNM 分期、门静脉癌栓及淋巴结转移患者肝癌组织中lncRNA CCHE1 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），肿瘤直径≥5 cm，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，有门静脉癌栓，及有淋巴结转移患者肝癌组织中lncRNA CCHE1 表达较肿瘤直径＜5 cm，TNM 分期I、Ⅱ期，无门静脉癌栓，及无淋巴结转移患者高。见表1。

表1 不同临床病理特征患者肝癌组织中lncRNA CCHE1相对表达量比较

2.3 肝癌组织中lncRNA CCHE1 对肝癌的诊断价值

以1.46 为诊断阈值，lncRNA CCHE1 诊断肝癌的ROC 曲线下面积（AUC）为0.814（95% CI：0.811，0.817），敏感性为72.31%（95% CI：0.693，0.734），特异性为79.24%（95% CI：0.743，0.831）。见图1。

2.4 lncRNA CCHE1 表达与肝癌患者总生存率的关系

以lncRNA CCHE1 中位数为界将患者分为高表达组和低表达组，各47 例。随访5年，高表达组平均生存时间为33.02 个月，生存率为19.15%，低表达组平均生存时间为46.57 个月，生存率为46.81%。两组生存率比较，差异有统计学意义（χ2=8.134，P=0.004），低表达组较高表达组高。两组5年生存曲线比较，差异有统计学意义（χ2=5.483，P=0.007）。见图2。

图1 肝癌组织中lncRNA CCHE1 诊断肝癌的ROC 曲线

图2 lncRNA CCHE1 高表达组和低表达组的生存曲线

3 讨论

lncRNA 长度＞200 个核苷酸，为一种非编码RNA[8]。在细胞所有的RNA 中，lncRNA 的数量远远超过mRNA，mRNA 占细胞所有RNA 的2%左右，lncRNA 所占比例＞90%[9-10]。有研究发现lncRNA 在转录后调控、表观遗传调控、剂量补偿效应等多种生命活动中发挥重要作用[11-12]。lncRNA 在恶性肿瘤的发生、发展中也发挥重要作用，研究lncRNA 为解释恶性肿瘤的发生、发展机制带来了新希望[13-15]。近年来lncRNA 在肝癌的发病中的作用也受到大家关注，有研究发现多种lncRNA 参与肝癌的发生、发展过程，如lncRNA HAR1A 和HAR1B 在中国乙肝病毒型肝癌中表达异常[16-19]。

笔者对乙型肝炎病毒感染相关肝癌组织中lncRNA CCHE1 表达进行研究，发现乙型肝炎病毒感染相关肝癌组织中lncRNA CCHE1 表达升高。lncRNA CCHE1 位于人类第10 号染色体基因上，最早发现lncRNA CCHE1 在宫颈癌组织中高表达，lncRNA CCHE1 过度表达导致宫颈癌预后不良[20]。后来发现lncRNA CCHE1 在多种恶性肿瘤组织中表达异常，参与多种恶性肿瘤的发病过程，如熊晶等[21]研究发现乳腺癌组织中lncRNA CCHE1 表达升高，乳腺癌组织中lncRNA CCHE1 与乳腺癌临床分期、淋巴结转移、肿瘤复发、预后指数相关，是乳腺癌的独立预后分子标志物；GABALLAH 等[22]发现lncRNA-CCHE1 在大肠癌中表达异常，与大肠癌的临床病理特征关系密切。XU 等[23]发现lncRNA CCHE1 参与胃癌细胞的增殖和凋亡过程；LIAO 等[24]研究发现lncRNA CCHE1 可促进非小细胞肺癌的增殖、侵袭、迁移，可以预后非小细胞肺癌的预后；JIN 等[25]发现lncRNA-CCHE1 可参与胰腺癌细胞的侵袭、迁移过程。故结合本研究结果和既往研究结果，分析lncRNA CCHE1 可能参与乙型肝炎病毒感染相关肝癌的发生、发展过程，其原因可能与lncRNA CCHE1 具有影响恶性肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移有关。

本研究结果显示，肿瘤直径≥5 cm，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，有门静脉癌栓，有淋巴结转移患者肝癌组织中lncRNA CCHE1 表达水平较肿瘤直径＜5 cm，TNM 分期I、Ⅱ期，无门静脉癌栓，无淋巴结转移患者高。表明肝癌组织中lncRNA CCHE1 相对表达量可反映患者病情的严重程度，分析lncRNA CCHE1 可能通过促进恶性肿瘤细胞增殖，抑制恶性肿瘤细胞凋亡，从而促进乙型肝炎病毒感染相关肝癌细胞增殖，故肿瘤直径大者lncRNA CCHE1 相对表达量高。lncRNA CCHE1 具有促进恶性肿瘤细胞侵袭、迁移的作用，故lncRNA CCHE1 可能通过促进肝癌细胞的侵袭、迁移，导致乙型肝炎病毒感染相关肝癌的TNM 分期升高、淋巴结转移、门静脉癌栓等。本研究同时发现lncRNA CCHE1 诊断肝癌的AUC 为0.814（95% CI：0.811，0.817），敏感性为72.31%（95% CI：0.693，0.734），特异性为79.24%（95% CI：0.743，0.831）；lncRNA CCHE1 低表达组的5年生存率（46.81%）较高表达组（19.15%）高。表明lncRNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相关肝癌的诊断和预后评价中具有一定的指导价值。本研究中，ROC 曲线评估lncRNA CCHE1 诊断肝癌的AUC 为0.814，具有较高的价值，但敏感性，特异性不高，表明其在乙型肝炎病毒感染相关肝癌的诊断中具有一定局限性，单独靠lncRNA CCHE1 指标进行诊断有不足之处，在临床上尚需结合病史及其他指标对乙型肝炎病毒感染相关肝癌进行诊断，lncRNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相关肝癌的诊断中具有一定的辅助指导价值。

综上所述，lncRNA CCHE1 可能参与乙型肝炎病毒感染相关肝癌的发生、发展，检测其表达对乙型肝炎病毒感染相关肝癌的病情评价、诊断和预后评估中具有一定的辅助指导价值。