口腔鳞状细胞癌患者唾液microRNA-342和Naa10p表达与颈淋巴结隐匿性转移的关系

淦岷，王永武，王丽，陆伟，段青云

（1.浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院 口腔科，浙江 杭州 310006；2.杭州市丁桥医院 口腔科，浙江 杭州 310022）

颈部淋巴结隐匿性转移是头颈外科恶性肿瘤研究的重点，尤其是对临床检查阴性（cN0）者进行颈淋巴结清扫一直存有争议[1]。黄建瑶等[2]学者报道cN0期口腔鳞状细胞癌（oral squamous carcinoma,OSCC）患者侧颈部淋巴结隐匿性转移率约为28.1%。目前临床颈部隐匿性转移淋巴结多为有创性，包括超声引导下针吸细胞学检查、正电子发射体层摄影术、前哨淋巴结活检术等，由于其对临床经验和检测技术要求较高，而且费用昂贵，因此难以在全国范围内开展[3]。目前与淋巴结转移密切相关的分子生物学有望为临床无创检测提供新的方法和思路。Naa10p 属于N-乙酰转移酶家族成员之一，其作用靶点众多、调控网络复杂，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等密切相关，在多种恶性肿瘤组织中呈高表达[4]。microRNA-342（miR-342）位于14 号染色体编码Enah/Vasp 样蛋白的内含子上，对舌癌、肝癌等的转移都有一定影响，关于miR-342 在OSCC 中的研究尚少。本研究旨在探讨OSCC 患者唾液中miR-342 表达和Naa10p 水平与临床病理特征和颈部淋巴结隐匿性转移的关系，旨在为OSCC 的临床诊断和个体化治疗提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年5月—2019年12月浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院接受原发灶扩大切除术及颈部淋巴结清扫术的OSCC 患者85 例作为OSCC 组。OSCC 组男性57 例，女性28 例；年龄28 ～76 岁，平均（56.01±11.78）岁；舌癌37 例，牙龈癌23 例，颊黏膜癌12 例，口底癌8 例，硬腭癌5 例；经术中或术后病理检查确诊为颈淋巴结隐匿性转移者35 例。同期于本院就诊的30 例癌前病变患者作为癌前病变组，其中男性18 例，女性12 例；年龄18 ～79 岁，平均（57.37±14.56）岁；口腔扁平苔癣患者14 例，口腔白斑患者11 例，口腔红斑者3 例，慢性溃疡长期不愈者2 例。随机选择同期于本院体检的健康志愿者30例作为对照组，经口腔检查确诊无口腔黏膜或牙周黏膜疾病，全身检查无系统性疾病。其中男性15 例，女性15 例；年龄22 ～80 岁，平均（59.23±16.71）岁。纳入标准：①原发性鳞状细胞癌；②首次确诊；③术前未经放、化疗及其他抗肿瘤治疗；④术前临床资料完整，经扪诊、影像学（CT、MRI）检查未发现颈部淋巴结转移，确诊为cN0。排除标准：合并其他恶性肿瘤、急慢性感染、严重肝和肾功能障碍、心脑血管疾病或其他有可能干扰miR-342 表达、Naa10p 水平表达者。本研究经医院医学伦理委员会批准，且与所有研究对象签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 唾液标本采集采集OSCC 组术前，癌前病变组确诊时及对照组入组时和晨起唾液标本，采集前需用清水漱口5 min。收集2 份未经刺激的唾液标本各2 ml，室温下离心，将清亮唾液保存至无菌样本管中，于-80℃保存备用。

1.2.2 qRT-PCR采用Trizol 法抽提唾液上清液总RNA。采用试剂盒进行逆转录，miR-342 茎环引物序列为：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGCC-3'，长度45 bp；内参小分子U6 snRNA 引物序列为：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，长度47 bp。以逆转录得到的cDNA 为模板，冰浴中配制20μl PCR 反应体系，包括2×SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10μl，cDNA 模板2μl，正反向引物各1μl，加入dd H2O 水适量。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40 个循环，60℃继续延伸5 min。将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，计算循环阈值。以2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.3 唾液Naa10p 检测严格按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，先配制标准品溶液，治疗浓度分 别 为2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml及0.00 pg/ml，检测酶标仪450 nm 处的光密度值，根据标准品的光密度值绘制标准曲线。另采用同样步骤检测样本的光密度值，计算其对应的质量浓度。

1.3 试剂和仪器

Naa10p 酶联试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司（检测范围31.25 ～2 000 pg/ml，检测限：9.64 pg/ml，重复性：板内变异系数＜10%，板间变异系数＜15%）。Trizol LS 试剂盒购自美国Invitrogen 公司，mirVana PARIS Kit 购自美国Ambion 公司，One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit 和SYBR Green PCR master Mix 购自日本TaKaRa 公司，酶标仪、iQ5 Realtime PCR System 购自美国Bio-Rad 公司。

1.4 统计学处理

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验。绘制ROC 曲线，影响因素的分析采用多因素Logistic 回归模型，相关性分析用Pearson 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组临床资料比较

各组唾液中miR-342 表达及Naa10p 水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；癌前病变组和OSCC 组miR-342 表达较对照组降低，Naa10p 水平较对照组升高（P＜0.05）。另外，OSCC组miR-342 表达较癌前病变组降低，Naa10p 水平较癌前病变组升高（P＜0.05）。各组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组临床资料比较

2.2 OSCC 患者唾液miR-342 与Naa10p 蛋白的相关性

经Pearson 相关性分析，OSCC 患者唾液miR-342与Naa10p 蛋白呈负相关（r=-0.693，P=0.000）。见图1。

2.3 OSCC 患者唾液miR-342 表达及Naa10p水平与临床病理特征的关系

不同肿瘤生长方式、肿瘤直径及是否发生颈淋巴结隐匿性转移的OSCC 患者唾液miR-342 表达及Naa10p 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

图1 OSCC 患者唾液miR-342 与Naa10p 蛋白的相关性散点图

表2 OSCC 患者临床病理特征与唾液miR-342、Naa10p 相对表达量的关系 （±s）

表2 OSCC 患者临床病理特征与唾液miR-342、Naa10p 相对表达量的关系 （±s）

临床特征 n miR-342 t/F 值 P 值 Naa10p 蛋白/（pg/ml） t/F 值 P 值性别男57 0.73±0.26 1.037 0.303 307.49±159.64 0.654 0.515女28 0.79±0.23 283.74±152.53年龄≤50 岁 26 0.81±0.24 1.376 0.173 313.62±168.31 0.542 0.589＞50 岁 59 0.73±0.25 293.52±152.59原发灶部位舌癌 37 0.73±0.25 0.323 0.862 307.63±171.16 0.063 0.993牙龈癌 23 0.76±0.26 297.37±153.32颊黏膜癌 12 0.72±0.27 295.18±148.74口底癌 8 0.83±0.24 278.19±152.02硬腭癌 5 0.78±0.24 296.44±143.61分化程度高-中分化 54 0.76±0.25 0.525 0.601 297.70±158.11 0.152 0.880低-未分化 31 0.73±0.26 303.10±157.09生长方式外生型 45 0.78±0.24 3.923 0.024 266.83±145.80 4.784 0.011溃疡型 28 0.78±0.27 301.86±175.06浸润型 12 0.57±0.15 417.71±89.06肿瘤直径T1（＜2 cm） 24 0.94±0.17 42.008 0.000 200.69±118.73 19.276 0.000 T2（2～4 cm） 43 0.77±0.20 290.84±121.53 T3/4（＞4 cm） 18 0.44±0.11 452.72±164.41颈淋巴结隐匿性转移否50 0.83±0.24 3.778 0.000 259.85±135.27 2.921 0.005是35 0.64±0.21 356.56±169.49

2.4 OSCC 患者唾液miR-342 和Naa10p 对颈淋巴结隐匿性转移的诊断价值

经ROC 曲线分析，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白诊断OSCC 患者颈淋巴结隐匿性转移的截断值分别为0.595、386.10 pg/ml，敏感性分别为80.00%（95% CI：0.670，0.888）和78.00%（95% CI：0.648，0.872），特异性分别为54.29%（95% CI：0.382，0.695）和42.86%（95% CI：0.280，0.571），AUC 分别为0.720（95% CI：0.614，0.827）和0.662（95% CI：0.546，0.778），唾液miR-342对颈淋巴结隐匿性转移的诊断效能高于唾液Naa10p 蛋白，差异有统计学意义（Z=7.145，P=0.000）。见图2。

2.5 颈淋巴结隐匿性转移的多因素Logistic 回归分析

以颈淋巴结隐匿性转移作为因变量，将性别、年龄、原发灶部位、肿瘤分化程度、生长方式、肿瘤直径、miR-342 及Naa10p 纳入回归方程进行多因素Logistic 回归分析（α入=0.05），结果显示：肿瘤浸润型生长方式、肿瘤直径＞4 cm（T3/4期）和唾液Naa10p蛋白＞386.10 pg/ml 为OSCC 颈淋巴结隐匿性转移的危险因素（P＜0.05），而唾液miR-342 ≥0.595 为OSCC颈淋巴结隐匿性转移的保护因素（P＜0.05）。见表3。

图2 唾液miR-342、Naa10p 蛋白诊断OSCC 患者颈淋巴结隐匿性转移的ROC 曲线

表3 颈淋巴结隐匿性转移的多因素Logistic 回归分析参数

3 讨论

手术是OSCC 最主要的治疗方式之一，由于头颈部的淋巴引流十分复杂，因此精确评估颈淋巴结转移对于选择合理的手术方式，以及疗效判断、预后评估都具有重要的临床价值[5]。但是目前尚缺乏有效的无创检测方法可准确判断颈部淋巴结的隐匿性转移灶，是导致肿瘤复发和患者预后较差的主要原因[6]。韩尚志等[7]通过回顾性分析111 例cN0OSCC 患者的临床资料，发现颈淋巴结隐匿性转移率为27.03%。胡馨元等[8]也证实，OSCC 颈部淋巴结的隐匿性转移是影响患者预后的独立危险因素。本研究共纳入了85 例接受原发灶扩大切除术及颈部淋巴结清扫术的cN0原发性OSCC 患者，其中35 例（41.18%）患者发生隐匿性转移，与其他文献中的流行病学数据大致一致[7-8]。

近些年，随着分子生物学技术的发展，基于RNA的生物标志物包括编码和非编码RNAs 逐渐被证实可用于恶性肿瘤的筛查和诊断[9]。Naa10p 属于N-乙酰转移酶蛋白NatA 唯一具有催化活性的亚基之一，通过催化肿瘤相关基因发生乙酰化或不依赖于乙酰化的协同转录抑制活性，从而参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移等恶性生物学行为[10]。郑军等[11]通过Envision TM 免疫组织化学法检测，证实OSCC 黏膜组织中Naa10p 蛋白的表达水平较白斑组织及正常黏膜组织均显著升高，并且与原发灶TNM 分期、淋巴结转移、组织学分化程度密切相关。目前血清、组织、粪便等都属于常用的用于肿瘤标志物检测的重要介质，但是笔者考虑到OSCC 位置特殊，与唾液密切接触，唾液中含有大量唾液腺腺体细胞分泌的酶类、激素、抗体等，以及肿瘤组织中渗出的细胞因子，而且样本采集方便、便于运输和保存等，因此在本研究中，笔者选择检测唾液中miR-342 和Naa10p。结果显示，Naa10p 在OSCC 患者唾液中的含量高于癌前病变患者和健康对照人群，这与郑军等[11]在OSCC 黏膜组织中的检测结果基本一致。另外，WANG 等[12]通过细胞实验证实，上调miR-342 表达可靶向调控急性粒细胞白血病细胞Kg1a 和HL60 中Naa10p基因的表达和转录，进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。SONG 等[13]也发现miR-342 在OSCC 发生、发展过程具有类似抑癌基因的活性，可作为OSCC 诊断和治疗的潜在靶点。在本研究中，OSCC 患者唾液中miR-342 相对表达量较癌前病变患者和健康对照人群显著降低，而且与唾液中Naa10p 蛋白呈负相关。

除此以外，唾液中miR-342 表达、Naa10p 蛋白水平均与原发灶生长方式、肿瘤直径和颈淋巴结隐匿性转移均密切相关。恶性肿瘤具有呈三维方向侵袭周围组织的形态学特征，韩尚志等[14]认为浸润型OSCC 患者发生颈淋巴结转移的的风险较外生型和溃疡型更高。MELCHERS 等[15]则证实原发灶浸润深度＞4.00 mm 可作为判断早期口腔癌（pT1cN0）颈淋巴结转移的临界阈值。Naa10p 与DNA 甲基转移酶1具有协同作用，以不依赖乙酰化活性的方式促进下游E-cadherin等抑癌基因CpG 岛甲基化，进而抑制其转录，促进肿瘤生长和转移。而miR-342 也可以靶向DNA 甲基转移酶1，抑制结肠癌细胞的生长和转移。另外，唾液中miR-342 和Naa10p 蛋白可作为颈淋巴结隐匿性转移的重要诊断指标。唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 可视为评估OSCC 颈淋巴结隐匿性转移的独立危险因素，而唾液miR-342 ≥0.595 可视为评估OSCC 颈淋巴结隐匿性转移的独立保护因素。唾液miR-342 对颈淋巴结隐匿性转移的诊断效能较Naa10p 蛋白更敏感，AUC＞0.7。考虑到本研究纳入的样本量偏少，不可避免会出现一定的假阳性结果，这也是本研究的主要缺陷。但是无论如何，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白表达差异对OSCC 患者的淋巴结转移确实有一定的预警价值，而且与患者肿瘤直径和肿瘤生长方式也有关联。

综上所述，OSCC 患者唾液miR-342 表达降低，Naa10p 蛋白水平升高，且两者具有靶向调控关系，唾液中miR-342 和Naa10p 表达与颈淋巴结隐匿性转移密切相关，有望成为早期诊断的潜在指标。对于唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 且唾液miR-342＜0.595 的OSCC 患者，建议进行淋巴结清扫术，以免二次手术或颈部肿瘤复发。