HPLC-MS/MS法分析刺参及其制品中海参多糖的含量

焦健， 朱振军， 佟志晏，马俊杰，辛丘岩，张彤彤，李凌霄，孙娜，宋爽*

(1.北京同仁堂健康(大连)海洋食品有限公司， 辽宁 大连 116045; 2.大连工业大学食品学院， 国家海洋食品工程技术研究中心，海洋活性多糖开发应用技术国家地方联合工程实验室， 辽宁 大连 116034; 3.广西大学轻工与食品工程学院， 广西 南宁 530004)

海参是中国的传统补益食品。其中，刺参(Apostichopusjaponicus)是中国养殖量最大的海参品种，其市场认可度高，价格也较高。但目前市场上刺参产品质量参次不齐，存在以次充好的现象。海参多糖是海参的重要营养功效成分，大量研究证实，海参多糖具有抗血栓、降血脂、增强免疫、抗肿瘤及调节肠道菌群等多种功效[1-5]。海参多糖主要包括岩藻糖基化硫酸软骨素和岩藻聚糖硫酸酯[6-7]。目前刺参中多糖含量的数据有限[8]，还未见对海参多糖含量影响因素研究的报道，因此有必要获得更多刺参及其制品中海参多糖的含量数据，并研究养殖地、养殖方式对海参多糖含量的影响，为刺参产品的质量控制和品质提升提供参考。

速发海参是近年盛行的一种新工艺，其优势是泡发时间短、流程简单快捷，深受广大消费者喜爱，而目前并未有相关文献对速发海参多糖含量的报道。针对上述问题，本研究依据水产行业标准(SC/T 3049—2015)的方法[9]，通过高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对采集自大连4个不同养殖地的4批次共16份海参样本中的海参多糖含量进行分析测定，比较了养殖地对海参多糖含量的影响，分析了速发海参产品的多糖含量及其与海参原料中多糖含量的相关性，并测定了大连和山东地区46批次海参样品的多糖含量数据，旨在为海参多糖含量研究及相关标准制修订提供参考依据。

1 实验

1.1 材料与仪器

1.1.1 海参

本实验所用海参样本均为刺参(Apostichopusjaponicus)，每份样本包括5～10只海参，每只新鲜海参重量范围为100～200 g。

考察养殖地对海参多糖含量影响的实验中，从4个养殖地(1#～4#)采集了生鲜刺参样本，4个养殖地均在大连地区，具体地点为皮口平岛(1#)、瓦房店沙山(2#)、瓦房店沙坨子(3#)和盐场(4#)，其中1#和2#为圈养养殖，3#和4#为底播养殖。在2016年10月至2017年5月间从每个养殖地采集4批生鲜海参，共计16份生鲜海参样本。

研究速发海参多糖含量的实验中，将采集自1#～4#养殖地的16份生鲜海参分别加工成速发海参，用于检测分析。速发海参加工由北京同仁堂健康(大连)海洋食品有限公司完成。

在海参多糖含量数据积累与分析实验中，又从46个不同的养殖地各采集了一份生鲜海参样本。这46个养殖地包括大连地区圈养养殖地4个，底播养殖地8个；山东(包括威海、烟台、东营和日照等)地区圈养养殖地16个，底播养殖地18个。采集时间为2016年10月至2017年6月。另外整合了1#～4#养殖地的16份生鲜海参的检测数据，共使用了62份生鲜海参的数据。

1.1.2 试剂与设备

木瓜蛋白酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。岩藻糖(纯度≥99%)和乳糖(纯度≥99%)购自Sigma公司。乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、半胱氨酸盐、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、乙酸钾和甲醇均购自天津市大茂化学试剂厂。其他试剂均为分析纯。Seven Compact pH计购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。台式冷冻离心机购自Thermo Scientific公司。LC-10AD/4000QTRAP串联质谱仪购自日本岛津公司和美国ABscix公司。

1.2 海参多糖含量测定

1.2.1 海参多糖制备

参照SC/T 3049—2015[9]方法制备海参多糖：新鲜与速发海参，剪成0.5 cm ×0.5 cm的小块，70 ℃烘干12 h，粉碎，过10目筛，混匀备用。准确称取各样品的海参干粉0.1 g，置于锥形瓶中，加入12.5 mL的含有5 mmol/L EDTA溶液和5 mmol/L半胱氨酸的0.1 mol/L乙酸钠缓冲溶液(pH 6.0)和10 mg木瓜蛋白酶，于60 ℃恒温水浴下搅拌，酶解反应24 h。然后，将反应后的混合物在8 500 rpm/min、20 ℃条件下离心10 min，取上清，加3.10 g乙酸钾，超声振荡混合均匀，于4 ℃静置12 h。最后，离心(8 000×g，10 min，20 ℃)取沉淀，定容于10 mL容量瓶中，即得海参多糖溶液。

1.2.2 酸水解

取0.5 mL海参多糖溶液于水解管中，加入0.5 mL 4 mol/L的三氟乙酸，密封，在110 ℃条件下水解3 h。冷却后减压除去溶剂，再加入0.5 mL甲醇，减压除去溶剂，重复以上步骤3次，达到去除三氟乙酸的目的。配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10和0.20 mg/mL的岩藻糖标准溶液按以上步骤水解。

1.2.3 PMP衍生化

水解产物用400 μL的氨水溶解，再加入400 μL 0.3 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.5 mg/mL的乳糖内标溶液，密封，70 ℃水浴30 min。冷却后减压除去溶剂，再加入1 mL甲醇，减压除去溶剂，重复以上步骤3次。然后加入1%的乙酸水溶液，再加入1 mL的氯仿，振荡后除去氯仿，重复萃取3次，水层作为供试液。供试液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进行HPLC-MS/MS液质分析。

1.2.4 HPLC-MS/MS条件

色谱条件：采用Thermo Scientific Hypersil Gold(150.0 mm× 2.1 mm，5 μm)色谱柱。柱温30 ℃，流动相为20 mmol/L乙酸铵-乙腈(88∶12，V/V)，体积流量0.5 mL/min。

质谱条件：离子源ESI+源，喷雾电压5.5 kV，辅助加热气温度600 ℃，氮气作为碰撞气和喷雾气，多重反应监测(MRM)模式。其它质谱分析参数见表1[8]。

表1 岩藻糖和乳糖的PMP衍生物的质谱分析条件Tab.1 Parameters for MRM analysis of PMP-labeled fucose and lactose

1.3 海参多糖含量计算

1.3.1 岩藻糖标准工作曲线建立

以岩藻糖与乳糖标准工作液浓度比为横坐标x，以其峰面积比为纵坐标y，绘制标准工作曲线。在本实验条件下，配制质量浓度为0.02～0.20 mg/mL范围的系列标准液，最终得到的标准曲线方程如下：y=1.579 9x-0.103 1，(R2=0.996)。将得到的峰面积带入标准曲线方程中，可得出供试样品中岩藻糖的浓度，由此浓度转化为海参多糖的浓度。

1.3.2 海参多糖含量计算

海参多糖含量按照SC/T 3049—2015[9]中的公式计算，根据海参样品中岩藻糖的含量和岩藻糖在海参多糖中的比例，将岩藻糖的含量乘比例系数(20)，即可计算出海参多糖的含量。

1.4 数据分析

所有实验重复3次，数据表示为(平均值±标准差)。利用SPSS 19软件对数据进行单因子方差分析，检验方差齐性，对不同数据进行Duncan多重比较，P<0.05表示数据差异显著。采用Pearson进行相关性分析。利用Excel和Origin 8.5作图。

2 结果与讨论

2.1 养殖地对海参多糖含量的影响

本研究首先分析了采集自4个养殖地的同一批次海参中多糖含量的差异，结果如图1A～图1D所示，所有批次中，2#养殖地的海参中多糖的含量都高于其他3个产地，含量为(94.36±15.71) mg/g(P<0.05)，其次是4#养殖地的海参，为(70.24±8.12) mg/g。整合每个养殖地4个批次海参多糖含量数据，结果如图1E，也显示2#养殖地的海参中多糖含量最高，其次为4#养殖地。以上结果表明，养殖地对海参中多糖的含量有明显影响，相较之下2#养殖地海参多糖含量最高。

已有研究表明，养殖方式对海参的生长、存活率、感官、加工性能以及营养成分都有显著的影响[10-11]。圈养海参蛋白、粗脂肪含量均高于底播养殖海参，而微量元素如硼、铬和铜元素含量均低于底播养殖海参[12]，但圈养海参常量元素含量却高于底播养殖海参[10]。本研究中，1#和2#为圈养养殖，3#和4#为底播养殖，两组间未呈现明显差异，不能说明养殖方式对海参多糖含量有显著影响。综上所述，不同养殖地的生鲜海参中多糖含量差异较大，但原因还有待进一步揭示。

2.2 速发海参多糖含量

表2 速发海参多糖含量Tab.2 Polysaccharide contents of Sufa sea cucumbers

将2.1部分的16份生鲜海参分别加工为速发海参后，检测它们的多糖含量。如表2所示，速发海参多糖含量在70.9～178.4 mg/g之间波动，其中1# 养殖地的第4批次海参制成的速发海参多糖含量相对较低，而4# 养殖地的第2批次的含量相对较高。速发海参相对于生鲜海参原料，多糖含量增加，这可能是因为海参本身含有16%(以干海参计)的盐分[13]，在速发海参产品加工过程中盐分被除去使多糖含量相对提高。

为了考察海参原料中多糖的含量与其制成的速发海参制品多糖含量间的关系，本研究对16批次生鲜海参与其制成的速发海参中的多糖含量的进行了相关性分析。由图2可知，生鲜海参多糖含量与其制成速发海参的多糖含量不存在显著相关性(r=0.16，P>0.05)。该研究结果说明，海参原料并不能显著决定其制成的速发海参产品中的多糖含量，产品的加工过程对速发海参产品的多糖含量有重要影响。

2.3 海参多糖含量数据的积累与分析

限制海参多糖的含量范围对提升海参的产品标准有重要意义。为了确定海参多糖的含量范围，本研究进一步检测了刺参主要养殖区(大连、烟台及威海等)46个养殖地的生鲜海参样本中的多糖含量，并整合前文2.1部分的16份生鲜海参多糖数据，共积累了62份生鲜海参多糖含量数据进行分析。结果如图3所示，62份样本中，生鲜海参中多糖含量最低为39.4 mg/g，最高为164.5 mg/g，差异非常大。将这些海参样本根据养殖方式分为底播养殖(n=34)和圈养养殖(n=28)两组，分析后发现，不同养殖方式的海参多糖含量不具有显著差异(P>0.05)。进一步分析海参多糖的含量分布，发现海参多糖含量主要集中在62～108 mg/g，如图4所示。目前对海参多糖含量数据报道非常有限，本研究结果可为海参多糖含量标准的设定提供数据参考。

3 结论

本研究通过对不同养殖地的海参及其速发海参产品中多糖含量的分析发现，养殖地对海参多糖含量有显著影响(P<0.05)；速发海参多糖含量范围为70.9～178.4 mg/g，速发海参多糖含量高于生鲜海参，但与作为其原料的生鲜海参多糖含量不存在显著相关性(r=0.16，P>0.05)；本研究汇总了62个生鲜海参样本数据进行分析，发现生鲜海参多糖含量范围为39.4～164.5 mg/g，主要集中在62 ～108 mg/g；养殖方式对海参多糖含量没有显著影响(P>0.05)。本研究结果揭示了养殖地、养殖方式对海参多糖含量的影响，可为海参产品标准中多糖含量的设定提供参考。