低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼血清和肝脏免疫酶及鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响

陈旭，王一福，周胜杰，于刚，杨蕊，马振华*

(1. 中国水产科学研究院南海水产研究所，热带水产研究开发中心；2. 三亚热带水产研究院: 海南 三亚 572018； 3. 农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广东 广州 510300)

尖吻鲈(Latescalcarifer)俗称盲曹、金目鲈、红目鲈等[1]。尖吻鲈为中国南方广泛养殖的鱼种，具有繁殖力强、生长速度快、生产操作管理相对容易、对饲料选择性低和对于高密度养殖环境耐受力强等优点。随着水产养殖业高密度养殖规模日益扩大以及未处理的工业、生活污水的排放，养殖生态环境遭到破坏，致使养殖病害频繁发生。目前主要依靠抗菌药来控制水产养殖动物疾病的发生，不仅使细菌耐药性增加，还导致抗菌药在生物体内残留。长期摄入含有抗菌药残留的食品，会对人体产生危害[2]。经研究，人类常见的癌症、畸形及部分慢性病的发生与食品中的抗生素、激素的使用和药物残留有关[3]。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)为多年生豆科草本植物，是常用中药，主要功效为补脾益气、清热解毒、和中缓急及调和诸药等，被誉为“众药之王”。其有效成分主要包括甘草黄酮、甘草酸、甘草次酸和甘草多糖等化合物[4]。中草药具有药用价值高、功能显著和副作用小等优点，在鱼类的细菌性疾病、真菌性疾病、寄生虫病以及病毒性疾病等方面取得了一定的成果[5]。甘草具有保护肝细胞、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节等多种药理作用和生物学功能[6-10]。研究表明，甘草具有增强新陈代谢和增加营养吸收的作用，并可以改变饲料口味，增强动物食欲[11]。甘草中的黄酮类化合物甘草素、甘草甲苷(Шa)及甘草乙苷(Шb)对DPPH自由基的平均清除率分别为51.56%、44.85%和34.53%[12]。甘草黄酮对小鼠DPPH自由基清除率为25.00%，对超氧阴离子自由基清除率为79.07%，对羟基自由基清除率为29.51%[13]。有研究表明：饲料中添加4.5%的甘草提取物可改善卡拉库尔羊(Karakul sheep)的血液免疫球蛋白和抗氧化状态[14],甘草酸苷(LTG)显著阻止成年斑马鱼(DanioRerio)高血糖的发生[15]；甘草粗提物明显提高鲫(Carassiusauratus)的抗应激能力，并能增强鱼体对细菌的抵抗力[16]；亚硝酸盐胁迫下，饲料中添加发酵甘草能够提高肝脏的谷胱甘肽过氧化物酶活性、丙二醛含量和总抗氧化能力[17]等指标。

养殖过程中，由于自然界存在季节更替、气候变化等环境的改变，鱼类生活的环境温度经常出现节律性或突发性的变动，且鱼苗运输过程中常采用低温保活法进行运输。水环境温度突发性的变化会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡[18-20]。因此，本试验通过在饲料中添加不同水平的甘草投喂尖吻鲈幼鱼(56 d)的方式，探究在温度胁迫下，甘草对尖吻鲈幼鱼血清和肝脏免疫酶以及鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响，为尖吻鲈的人工养殖和运输提供重要的理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验用鱼与试剂

试验用尖吻鲈幼鱼于2019年8月由南海水产研究所热带水产研究开发中心(海南省陵水县)自行培养，在饲料中添加不同水平的甘草投喂56 d。胁迫试验用鱼平均体长为(9.42±2.37)cm，平均体质量为(14.73±3.05)g。

试验测量试剂购自上海医疗器械股份有限公司，药液随用随配。测定过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LZM)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化物酶(POD)和超微量Na+-K+-ATP酶所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 饲养饲料的配制

尖吻鲈幼鱼饲养饲料中甘草粉的添加量分别为0、10、30和50 g/kg。饲养饲料自行制作，严格把控质量。其中，甘草粉购自亳州市德永堂生物科技有限公司(不含添加剂)。饲料原料粉混匀后加40%自来水搅拌均匀，制成粒径为3.0 mm的颗粒，晒干后置于-20 ℃冰箱中保存备用。配方见表1。

表1 饲料配方及成分表Tab.1 Feed formula and ingredient list %

1.3 试验方法

采用单因子浓度梯度法，在基础饲料中分别添加0、10、30和50 g/kg，以不添加甘草的基础饲料组为对照组。将试验用尖吻鲈幼鱼分成4组，每组3个重复，每桶放幼鱼40尾，共480尾。在室外玻璃纤维桶(500 L)进行养殖，每天分2次(08∶00和17∶00)进行饱食投料，视水质情况进行换水并定期吸污(每隔5天)。饲养期为56 d，期间不进行水体消毒和药物投喂。养殖结束后，每桶选取体质健康、体表无伤、活力强且规格相近的15尾尖吻鲈幼鱼，相应移入室内塑料桶(100 L)进行低温(18 ℃)胁迫试验。每桶试验水体积约为40 L。每个塑料桶都有一个塑料网盖，以防止幼鱼跳出。温度由冷水机(HXLS3000，大连汇新钛设备开发有限公司)控温，不间断充气，低温胁迫时长为24 h。试验用水为经过砂滤的自然海水，主要水质指标如下：pH 7.5、氨氮<0.01 mg/L、亚硝酸盐<0.02 mg/L。

低温胁迫试验结束后，进行断尾取血，并取肝脏和鳃部位，制成血清和组织匀浆后，放入-80 ℃冻存备用。样品分析前于4 ℃冰箱中解冻，在匀浆器中匀浆，并用0.02 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液稀释10倍制成匀浆液。在4 ℃下，5 000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒所提供的方法进行酶指标的测定。

1.4 数据统计

试验数据利用SPSS 19.0软件进行统计分析并进行单因素方差分析(one-Way ANOVA)，各试验组间存在差异用Duncan’s多重比较，当P<0.05时为差异显著，结果用平均值±标准差(Mean ± SD) 表示，并利用Microsoft Office Excel 2016软件作图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼血清和肝脏免疫酶的影响

表2 低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼血清免疫酶的影响Tab.2 Effect of Glycyrrhiza uralensis on serum immune enzymes of Asian seabass larvae under low temperature stress

表3 低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼肝脏免疫酶的影响Tab.3 Effects of Glycyrrhiza uralensis on liver immune enzymes of Asian seabass larvae under low temperature stress

表2中，低温胁迫下，甘草含量3%组和5%组组间尖吻鲈幼鱼血清CAT活性差异不显著，均显著高于对照组和1%组，1%组显著低于对照组(P<0.05)；5%甘草对尖吻鲈鱼幼鱼血清T-SOD活性和T-AOC影响一致，组血清T-SOD活性最高，均显著高于其它各组(P<0.05)，且其它各组组间差异均不显著；低温胁迫下，尖吻鲈幼鱼血清MDA含量和GSH-PX活性在试验过程中差异无统计学意义(P>0.05)；尖吻鲈幼鱼各试验组血清LZM含量显著高于对照组(P<0.05)，1%组和5%组组间LZM含量差异均不显著，均显著高于3%组。

由表3可知，低温胁迫下，尖吻鲈幼鱼肝脏CAT和POD活性在试验过程中差异无统计学意义(P>0.05)；各试验组组间肝脏T-SOD活性差异均不显著，均显著高于对照组(P<0.05)；3%和5%组组间肝脏MDA含量差异不显著，均显著低于1%组和对照组(P<0.05)，且1%组和对照组组间MDA含量差异不显著；5%组肝脏GSH-PX活性最高，与1%和3%组相比差异不显著，显著高于对照组(P<0.05)，对照组、1%和3%组组间差异均不显著；1%组肝脏T-AOC最高，均显著高于其它各组(P<0.05)，其它各组组间差异均不显著。这些数据表明，在低温胁迫下，饲养含有甘草的饲料能够提高尖吻鲈幼鱼血清和肝脏免疫力，抑制低温胁迫对吻鲈幼鱼造成的免疫应激反应。

2.2 低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响

低温胁迫下甘草对尖吻鲈鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响见图1。如图1所示，温度胁迫下，各试验组鳃Na+-K+-ATP酶活性均显著低于对照组(P<0.05)；1%组与5%组差异不显著，均显著低于0%组(P<0.05)。

3 讨论

研究证明，甘草及其生物活性成分对人类、动物及水生生物等的免疫系统起到一定的调节作用[21-25]。本研究选取具有代表性的免疫酶如：过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、溶菌酶(LZM)、总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化物酶(POD)以及Na+-K+-ATP酶，这些酶类在识别和消除异物、提高吞噬细胞的吞噬能力、促进机体代谢、提高机体免疫力和抗氧化能力等方面起重要作用，可以通过其变化分析低温胁迫下不同水平的甘草含量对尖吻鲈鱼幼免疫力以及鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响。

3.1 低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼血清和肝脏免疫酶的影响

已有研究发现：日粮中加入甘草可显著提高黄鲈(Percaflavescens)血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和溶菌酶活性[26]；甘草对施氏鲟(Acipenserschrencki)部分免疫器官中溶菌酶活性均有一定提高和促进作用[27]；饲料中添加甘草甜素投喂点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)，投喂甘草甜素7 d，350 mg/kg和500 mg/kg组的血清LZM以及投喂甘草甜素14 d，50 mg/kg组的LZM活力均显著升高[28]；对鲫腹注甘草粗提物，低剂量组血清溶菌酶活性无明显变化，仅在第14天显著高于对照组，高剂量组从第7天开始每次均显著高于对照组[29]；5 μg/mL和10 μg/mL的甘草次酸能显著促进建鲤(CyprinuscarpiovarJian)肝脏中SOD、GPX活性水平的恢复、同时极显著抑制MDA合成[30]；饲料中添加甘草次酸养殖8周后，在斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)腹腔注射大肠杆菌脂多糖(LPS)，24 h后显著提高了肝脏SOD和CAT水平，并显著降低MDA含量[31]，以上研究结果与本试验类似。本试验中，饲料中添加甘草养殖56 d后，对尖吻鲈幼鱼进行24 h的低温(18 ℃)胁迫。结果显示，低温胁迫下，不同水平含量的甘草对尖吻鲈幼鱼血清MDA含量、GSH-PX和肝脏CAT、POD活性的影响在试验过程中无统计学差异；血清T-SOD、T-AOC、LZM和肝脏T-SOD、GSH-PX、T-AOC均有不同程度的升高，较高甘草含量(3%组和5%组)显著抑制肝脏MDA活性。这说明，投喂尖吻鲈幼鱼56 d后，低温胁迫下，甘草能够提高鱼体免疫力，抑制低温胁迫的免疫应激。不同的是，低温胁迫下，血清CAT活性随着甘草含量的增加先降低后升高。可能的原因是由于投喂添加甘草含量1%的尖吻鲈幼鱼受到低温刺激时，产生了大量过氧化氢，而机体为清除这些过氧化氢，消耗了血清中大量过氧化氢酶，致使血清过氧化氢酶活性降低。而饲料中甘草含量较高(3%和5%)，尖吻鲈幼鱼受到低温胁迫时，机体应激机制作出反应，导致血清过氧化氢酶升高，以增强机体对氧自由基和过氧化氢等物质的清除能力。

3.2 低温胁迫下甘草对尖吻鲈幼鱼鳃Na+-K+-ATP酶活性的影响

鳃是鱼类呼吸、氨氮排泄及渗透调节的主要部位，是鳃组织泌氯细胞及细胞器的膜上存在的一种蛋白酶，在鱼体渗透调节过程中起着非常重要的作用[32-33]。研究表明，使用添加甘草次酸的饲料饲喂团头鲂幼鱼(Megalobramaamblycephala)56 d后，肠道Na+-K+-ATP酶活性无显著差异[34]；将草鱼(Ctenopharyngodonidellus)浸泡于氯氰菊酯中，对草鱼鳃组织Na+-K+-ATP酶活性影响与对照相比无显著差异[35]；使用添加了α-酮戊二酸的饲料投喂养于氨氮浓度为18.37 mg/L水体中的草鱼42 d后，对鳃Na+-K+-ATP酶活性均无显著差异[36]；饲料中添加喹乙醇饲喂鲤60 d后，鳃Na+-K+-ATP酶活性随喹乙醇剂量的升高而呈逐渐下降的趋势[37]；甲氰菊酯对鲤亚急性毒性试验中，甲氰菊酯的质量浓度越高，对鳃Na+-K+-ATP 酶活性的影响越大，随着时间的延长，其总体变化呈先下降后上升的趋势[38]；90 d的饲养结果表明，低质量浓度镧暴露时对条纹锯鮨(Centropristisstriata)鳃Na+-K+-ATP酶呈激活状态，在高质量浓度镧作用下，Na+-K+-ATP酶活性没有明显变化[39]；上述几种试验结果存在异同，可能是由于药物品种、用药方法、试验物种及组织器官等不同，对试验结果造成差异。本试验中，低温胁迫下，鳃Na+-K+-ATP酶活性随着甘草含量的增加呈先降低后升高的变化趋势并均显著低于对照组。其原因可能是，尖吻鲈幼鱼受到低温刺激后，鳃组织器官受到一定程度的氧化损伤，鳃组织泌氯细胞变性，改变了鳃Na+-K+-ATP酶蛋白的构象和功能，对鳃Na+-K+-ATP酶活性产生了抑制作用。而饲喂甘草含量较高(5%)的尖吻鲈幼鱼受到低温刺激后，鱼体通过自我调节表现出较强的适应性，通过增加鳃氯细胞的密度和相应的Na+-K+-ATP酶活性来维持体内的离子平衡，使Na+-K+-ATP酶活性上升。

4 结论

本研究发现，低温胁迫下，饲料中添加甘草能显著提高尖吻鲈幼鱼血清CAT活性、T-AOC和LZM含量并且提高肝脏中T-SOD、GSH-PX和T-AOC活性。说明饲料中添加甘草能提高尖吻鲈幼鱼免疫力和鳃Na+-K+-ATP酶活性，减少机体组织损伤，从而提高尖吻鲈幼鱼在面对突发性温度下降时的生存能力。但这些作用机理是否存在其他物质的参与和协调，遵循何种信号通路，以及如何进行物质和能量交换以适应不同环境的要求还需更加深入的研究。