补青颗粒对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞氧化损伤的影响

袁玲 鲁玉梅 牛阳 南一

摘要：目的 探讨补青颗粒对过氧化氢诱导的晶状体上皮细胞的作用，研究其作用的相关信号通路和发生机制。方法 用H2O2诱导人晶状体上皮细胞（HLEC）氧化损伤模型，给予补青颗粒含药血清干预，用CCK-8法检测补青颗粒含药血清对HLE细胞活力的影响，划痕实验检测迁移能力的影响。结果 在10 nM/L H2O2组出现细胞增殖活力最高点，从最低浓度的1 nM/L到10 μM/L浓度，H2O2能刺激细胞促进细胞增生，并且在6、12、24 h各时间点细胞的增殖活力均高于空白组。CCK-8结果显示，模型组与空白组相比较，其细胞增殖力显著降低（P<0.01）;与模型组比较，QJ组、H2O2+L组、H2O2+M组、H2O2+H组其细胞增殖力均显著增加（P<0.01），差异有统计学意义。划痕实验显示补青颗粒可以一定程度的促进细胞迁移能力。结论 补青颗粒具有抑制H2O2诱导的氧化应激反应，对氧化损伤的HLEC有促进细胞增值活力及細胞迁移能力。

关键词：补青颗粒;过氧化氢;晶状体上皮细胞

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）09-0067-06

Effect of Buqing Granules on the Lens Epithelial Cell OxidativeDamage Induced by Hydrogen Peroxide

YUAN Ling1，2，3，LU Yu-mei1，NIU Yang1，Nan Yi1

（1. Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China; 2. Ningxia Engineering and Technology Research Center for Modernization of Hui Medicine，Yinchuan 750004，China： 3. Ningxia Collaborative Innovation Center of Hui Medicine，Yinchuan 750004，China）

【Abstract】Objective： To explore the effect of Buqing Granules on lens epithelial cells induced by hydrogen peroxide and to study the related signal pathways and mechanisms. Methods： H2O2 was used to induce the oxidative damage model of human lens epithelial cells（HLEC），and Buqing granules drug-containing serum was used for intervention. The effect of Buqing granule drug serum on the viability of HLE cells was detected with CCK-8 method and the migration ability impact was detected with the scratch test. Results： The highest cell proliferation activity appeared in the 10 nM/L H2O2 group. From the lowest concentration of 1 μM/L to 10 μM/L，H2O2 could stimulate the cells to promote cell proliferation，and at 6th h，12th h and 24th h each time point，the proliferation activity of cells was higher than that of the blank group. CCK-8 results showed that the cell proliferation of the model group was significantly lower than that of the blank group（P<0.01）. Compared with the model group，the cells in the QJ group，H2O2+L group，H2O2+M group and H2O2+H group，the proliferation ability increased significantly（P<0.01），and the difference was statistically significant. The scratch experiments showed that Buqing Granules can promote cell migration to a certain extent. Conclusion： Buqing Granules can inhibit the oxidative stress response induced by H2O2，and can promote cell proliferation and cell migration to oxidatively damaged HLEC.

【Key words】Buqing Granules，hydrogen peroxide，lens epithelial cells

年龄相关性白内障（ARC）是白内障里较为常见的一种，属中医学“圆翳内障”的范畴，具体指晶珠混浊，视力缓慢渐降至失明的慢性眼病[1]。古代医籍记载其病因病机有以下几种：（1）肝肾不足，阴精亏损不能上荣于目，晶珠失养则混浊;（2）脾虚气弱，不能送精气上达于目，则晶珠失养而混浊;（3）气血亏虚，晶珠失养而混浊;（4）肝热上扰，晶珠出现混浊。ARC是晶状体衰老的一种表现[2]。迄今仍然没有研制出能够有效预防和延缓年龄相关性白内障发生和发展的药物。西医研究其发病机制较为复杂，许多因素可导致ARC的发生[3]，如：氧化作用[4-5]、遗传、紫外线、饮食、用药、外伤、放射性射线等[6]，都是导致晶状体混浊的重要原因。与此同时，其发病机制与多种因素有关，由多种因素共同作用的结果。例如：晶状体遭受氧化损伤、辐射损伤、老化变性[7]、晶状体蛋白的基因突变、葡萄糖过度刺激、半乳糖代谢障碍、脂质过氧化损伤等均可对晶状体造成不同程度的损伤，导致晶状体发生混浊，影响晶状体对光的透射和折射，造成视物不清[8]。俞洋等[9]用补清汤治疗未成熟期ARC35例62眼，总有效率为75.81%。补青颗粒出自《杨氏家藏方》，具有补肝益肾，利水消肿明目的作用，且已证实在临床上疗效显著。因此，本实验拟观察：不同浓度补青颗粒对人晶状体上皮细胞增殖和细胞迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞 人晶状体上皮细胞，SRA01/04（HLEC）：3111C0001CCC000206（购买于国家实验细胞资源共享平台）。将人晶状体上皮细胞（HLEC）放在含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基的25cm2培养瓶中，放进37℃、5%的CO2培养箱中静置培养，定时观察细胞的生长情况。待细胞融合至70%～80%时用0.05%的胰酶消化后，根据细胞密度，按合适比例进行传代，选生长状态良好的晶状体上皮细胞进行实验。

1.1.2 实验药物 ①补青颗粒：菟丝子20 g，熟地黄20 g，枸杞子20 g，车前子10 g，地骨皮10 g，白茯苓20 g，甘菊花10 g，方中各药品均经宁夏医科大学中医学院鉴定并制成配方颗粒（专利号：201210013342.8）。临用前用生理盐水配制成浓度为：高浓度4 g/mL、中浓度2 g/mL、低浓度1 g/mL的混悬液。②杞菊地黄丸：北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产，临用前用生理盐水配制成浓度为1 g/mL的混悬液。

1.1.3 实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠50只，随机分成5组，每组10只。标准体重（由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（宁）2016-0001。分笼饲养，相对湿度50%～70%，室温25℃～27℃。适应性喂养7日后用于实验。

1.1.4 实验试剂 DMEM培养基（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国Gibco公司）、胰蛋白酶（美国Gibco公司）、PBS盐酸缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）、Cell Counting Kit-8试剂盒（日本Dojindo公司）、水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）、4%多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇（天津市化学试剂厂）、过氧化氢（天津市化学试剂厂）。

1.1.5 实验仪器 SW-CJ-1F1型超净工作台（中国苏州净化设备有限公司）、Heal Force HF90 CO2培养箱（中国苏州净化设备有限公司）、DFD-700水浴箱（天津市工兴电器厂）、5804R型超速低温冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、-80超低温冰箱（日本三洋电器股份有限公司）、CKX31型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）、CKX41自动显微照相装置（日本Olympus公司）、BD FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）、Mode1680酶标仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清的制备 将50只大鼠随机分为5组，即：补青颗粒高剂量组（4 g/mL）、补青颗粒中剂量组（2 g/mL）、补青颗粒低剂量组（1 g/mL）、杞菊地黄丸组（1 g/mL），空白组（0.9%Nacl溶液），每组10只，分别给予相应浓度的中药汤剂灌胃，每天2次，时间间隔8 h左右，连续灌胃7 d，于末次给药后1h腹主动脉取血，收集血液。取血完成后将血液静置3 h左右，放入离心机，3000rpm，离心15min。用移液枪吸取上层血清，放入1.5 mLEP管中，做好标记，放入-80℃冰箱保存。

1.2.2 实验分组 ①空白对照组（KB+CON）：HLEC培养液+10%空白组血清;②模型组（H2O2+CON）：HLEC培养液+100 μM/LH2O2+10%空白组血清;③阳性对照组（H2O2+QJ）：HLEC培养液+100 μM/LH2O2+10%杞菊组血清;④补青颗粒高浓度组（H2O2+H）：HLEC培养液+100 μM/LH2O2+10%补青颗粒高浓度组血清;⑤补青颗粒中浓度组（H2O2+M）：HLEC培养液+100 μM/LH2O2+10%补青颗粒中浓度组血清;⑥补青颗粒低浓度组（H2O2+L）：HLEC培养液+100 μM/LH2O2+10%补青颗粒低浓度组血清。

1.2.3 CCK-8法检测各组细胞增殖活性 取对数生长期的HLEC细胞，吸出细胞上清液，加入2 mL的PBS轻轻洗涤细胞后弃去，用0.25%的胰蛋白酶消化，1000 rpm 5 min离心，制成单细胞悬液后按照4×104个/孔细胞接种于96孔板，每空中加入100 μL的10%细胞培养液，放置在细胞培养箱中常规培养24 h，待充分贴壁后。按实验分组进行处理。空白对照组（KB+CON）每孔加入100 μL大鼠空白血清、模型组（H2O2+CON）每孔加入100 μL 大鼠空白血清、阳性对照组（H2O2+QJ）每孔加入100 μL大鼠杞菊地黄丸血清、补青颗粒高（H2O2+H）每孔加入4 g/mL 100 μL大鼠補青颗粒高浓度血清、中（H2O2+M）每孔加入2 g/mL 100 μL大鼠补青颗粒中浓度血清和低（H2O2+L）每孔加入1 g/mL 100 μL大鼠补青颗粒低浓度血清组。于24 h后弃去上清液，分别在待测孔中加入10 μL的CCK-8试剂，避光孵育4h，用酶标仪在450nm处读取各孔OD值。每组设3个复孔，反复试验3次。

1.2.4 划痕实验检测细胞迁移能力 取出对数生长期细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，之后将其转移到15 mL离心管进行离心，离心后弃掉上清液，加入培养液充分吹打均匀成单细胞悬液，按1×105个/孔，每孔2 mL铺到六孔板中。放入培养箱中培养24 h，待其充分贴壁之后，吸去上清液，用PBS洗一遍，各组加入含药血清处理，用0.1 mL移液器枪头在培养板中央划“-”字形划痕，在倒置显微镜下观察记录划痕区，镜下拍照，每组拍3张。之后在6、12、24 h倒置显微镜下观察记录划痕区。

1.2.5 统计学方法 实验数据用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS21.0统计软件进行进行单因素方差分析，方差具有齐性时用S-N-K检验，方差不齐用Dunnett-t3检验进行各组间比较。当P<0.05表示差有统计意义。

2 实验结果

2.1 不同浓度H2O2在不同时间内对人晶状体上皮细胞增殖活力的影响 用CCK-8法检测不同浓度的过氧化氢对细胞增殖活力，结果显示在10 nM/LH2O2组出现细胞增殖活力最高点（图1），从最低浓度的1 nM/L到10 μM/L浓度，H2O2能刺激细胞促进细胞增生，并且在6、12、24 h各时间点细胞的增殖活力均高于空白组，而且在低浓度的范围内有剂量依赖的趋势;而在高浓度的1 mM/L和500μM/LH2O2处理组，晶体上皮细胞增生活力全部低于空白组，此实验结果同以往相似，且呈现出近似于一条横行的直线，说明细胞在此浓度无任何增殖活力;在0 h时，100μM/L处理组增殖达到最低点（图1）。

2.2 补青颗粒含药血清对H2O2刺激后人晶状体上皮细胞增殖的影响 CCK-8结果显示，H2O2+CON（模型组）组与KB+CON组（空白组）相比较，其细胞增殖力显著降低（P<0.01），差异有统计学意义。与模型组比较，QJ组、H2O2+L组、H2O2+M组、H2O2+H组其细胞增殖力均显著增加（P<0.01），差异有统计学意义。与QJ组相比较，H2O2+L组其细胞增殖能力无显著性差异;H2O2+ M组细胞增殖能力显著增加（P<0.01）;H2O2+H 组其细胞增殖能力降低（P<0.05），差异有统计学意义。（表1）。

2.3 划痕试验结果 如表2所示，①在正常组（KB+CON）的细胞，12 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.05），差异有统计学意义;24 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.01）;较6 h相比缩短（P<0.05），差异有统计学意义。②在模型组（H2O2+CON）的细胞，12 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.05）;24 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.01）;24 h中细胞划痕区两端距离较6 h相比缩短（P<0.05），差异有统计学意义。③补青颗粒低浓度组（H2O2+L）的细胞，12 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.05）;24 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.05），差异有统计学意义。④补青颗粒中浓度组（H2O2+M）的细胞，6 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.05）;12、24 h中细胞划痕区两端距离较0 h相比缩短（P<0.01）;12、24 h中细胞划痕区两端距离较6 h相比缩短（P<0.01）;24 h中細胞划痕区两端距离较12 h相比缩短（P<0.05），差异有统计学意义。

3 讨论

白内障是世界主要致盲性疾病之一，ARC是其最常见的类型[10]，它的发生、发展是多因素综合作用的结果，研究发现各种刺激因素诱发晶状体产生氧自由基是白内障发生的重要因素，过氧化氢是氧自由基的一种，通过产生羟自由基引起氧化反应，对细胞损伤较大。而晶状体上皮细胞在受到氧化刺激时，产生大量氧自由基，当这些自由基超过人体清除能力时，就会造成氧化应激[11]，氧化应激在白内障的发病过程中起着很重要的作用。氧化损伤是诱发ARC的主要因素。晶状体上皮细胞是晶状体代谢最活跃的部位，晶状体还原状态的维持主要依靠晶状体上皮细胞产生的各种抗氧化酶，晶状体上皮细胞的凋亡将导致其功能丧失，无法合成各种酶[12]。我们利用立体培养晶状体上皮细胞技术，采用过氧化氢氧化损伤法，诱发出实验性年龄相关性白内障细胞模型[13]。Spector[14]等测定正常人晶状体和房水中的H2O2浓度大约为20～30 μM，而1/3白内障患者的晶状体H2O2水平比正常人高2～7倍[15]。几乎所有白内障患者的房水H2O2浓度均高于正常人，平均值为82 μM，最高可达663 μM[16]。

故通过查阅过往文献，本研究选择了9个H2O2浓度（0 nM/L即1640组、1 nM/L、10 nM/L、100 nM/L、10 μM/L、50 μM/L、100 μM/L、500 μM/L、1 mM/L）和作用时间（0 h即40 min、6、12、24 h）。在实验中，用CCK-8法检测不同浓度的过氧化氢对细胞增殖活力的结果显示，在10 nM/LH2O2组出现细胞增殖活力最高点（表1），从最低浓度的1 nM/L到10 μM/L浓度，H2O2能刺激细胞促进细胞增生，并且在6、12和24 h各时间点细胞的增殖活力均高于1640组（无H2O2），而且在低浓度的范围内有剂量依赖的趋势;而在最高浓度的1 mM/L和500 μM/LH2O2处理组，晶体上皮细胞增生活力全部低于1640对照组，此实验结果同以往相似[17]，且呈现出近似于一条横行的直线，说明细胞在此浓度无任何增殖活力;在0 h时，100 μM/L处理组增殖达到最低点（图1）。浓度在10 nM/L 时H2O2的刺激增生效应最强。H2O2对晶状体上皮细胞增殖活力的影响存在明显的浓度依赖性，高浓度的H2O2引起细胞引起细胞凋亡，低浓度的刺激细胞增生，这和以往文献实验结果相符。在40 min时，100 μM/L处理组增殖达到最低点。故采用了浓度为100 μM/L的H2O2处理时间为40 min作为ARC的最佳造模浓度。Kleiman等发现H2O2可诱导培养的牛晶状体上皮细胞发生DNA 单链断裂。刘海平等[18]在实验中用H2O2浓度为100 μM/L造模。故通过参考其他文献及在此实验中得到的实验结果后采用100 μM/L H2O2作为过氧化氢诱导氧化损伤的造模浓度。

本实验笔者将细胞分了6组：空白组（KB+CON）、模型组（H2O2+CON）、阳性对照组（H2O2+QJ）、补青颗粒低浓度组（H2O2+L）、补青颗粒中浓度组（H2O2+M）、补青颗粒高浓度组（H2O2+H）。实验中发现，杞菊地黄丸组的细胞增殖力显著高于模型组，说明杞菊地黄丸对氧化损伤的细胞有很好的保护作用;而补青颗粒低浓度组和中浓度组的细胞增殖力均显著性高于杞菊地黄丸组，故补青颗粒低浓度和中浓度组的抗氧化损伤能力要高于杞菊地黄丸组;补青颗粒的抗氧化损伤能力与其剂量无显著相关性。

在进行细胞划痕实验时，笔者将细胞分了5组：空白组（KB+CON）、模型组（H2O2+CON）、补青颗粒低浓度组（H2O2+L）、补青颗粒中浓度组（H2O2+M）、补青颗粒高浓度组（H2O2+H），并设了4个时间点：0、6、12、24 h。以五组当中的每个0 h作为首要对照组。①正常组（KB+CON）的细胞，在6 h后，细胞划痕区两端细胞较0 h时无明显变化，直至12、24 h后细胞开始向划痕区移行;②模型组（H2O2+CON）的细胞，在6 h后，细胞划痕区两端细胞较0 h时无明显变化，而在24 h后划痕区两端细胞移行较明显;③补青颗粒低浓度组（H2O2+L）的细胞，与正常组相似，都是在12、24 h细胞移行明显;④补青颗粒中浓度组（H2O2+M）的细胞，从6 h后细胞开始移行明显，随着时间的延长，细胞移行越来越明显;⑤而补青颗粒高浓度组（H2O2+H），划痕区两端细胞一直无明显变化。此结果说明了补青颗粒中浓度组（H2O2+M）有明显的促进细胞移行的作用。

综上所述，本实验所用的补青颗粒具有抑制H2O2诱导的氧化应激反应，对氧化损伤的HLEC有促进细胞增值活力及迁移能力的作用，从而保护受损的晶状体上皮细胞。

参考文献：

[1]王建英.药物治疗早期老年性白内障[J].眼科新进展，2002（6）：415-416.

[2]李元彬，陈薇，朱风云，等.p53和bcl-2在老年性白内障晶状体上皮细胞中的蛋白表达[J].眼科新进展，2002（6）：387-389.

[3]关小荣，周健，惠延年，等.过氧化氢对人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响[J].国际眼科杂志，2008（3）：479-482.

[4]丁建光李含玉曾令柏王家翠杨策尧.晶状体上皮细胞凋亡与过氧化氢诱导白内障形成研究[J].眼科研究，2001（3）：202-204.

[5]郭露，呂红彬.VEGF基因多态性与糖尿病视网膜病变的关系[J].眼科新进展，2015，35（4）：397-400.

[6]陈星，刘黎明.老年性白内障患者房水中氧化应激物质含量的测定[J].眼科新进展，2011，31（4）：341-344.

[7]唐建.白内障发病机制的分子学研究进展[J].眼科新进展，2003（1）：52-55.

[8]高婧，黄旭东，姜雅琴.调节因素与年龄相关性白内障发病的关系[J].滨州医学院学报，2011，34（2）：105-107.

[9]俞洋，冯振娥，赵晓林，等.补青汤治疗未成熟期年龄相关性白内障35例临床观察[J].宁夏医科大学学报，2011，33（5）：496-497.

[10]陆萍邹菊生.障翳散治疗老年性白内障的疗效观察[J].上海中医药杂志，2001（11）：26-28.

[11]田军，朱龙飞，坚哲，等.过氧化氢诱导人黑素细胞氧化应激损伤模型的建立[J].实用皮肤病学杂志，2014，7（6）：406-410.

[12]丁建光李含玉曾令柏王家翠杨策尧.晶状体上皮细胞凋亡与过氧化氢诱导白内障形成研究[J].眼科研究，2001（3）：202-204.

[13]林燕瑜.胰岛素样生长因子-1受体在小鼠氧化损伤性白内障和透明晶状体中的表达[D].福建医科大学，2008.

[14]Ma T，Chen T，Li P，et al.Heme oxygenase-1（HO-1）protects human lens epithelial cells（SRA01/04）against hydrogen peroxide（H2O2）-induced oxidative stress and apoptosis[J].Exp Eye Res，2016，146：318-329.

[15]李树杰.STZ诱导的大鼠糖尿病性白内障的发病机制及绿茶的防治效果研究[D].山东中医药大学，2007.

[16]梁明.白内障患者房水及血清中氧化应激指标及血管内皮生长因子的变化[J].海南医学院学报，2014，20（3）：418-420.

[17]关小荣，周健，惠延年，等.过氧化氢对人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响[J].国际眼科杂志，2008（3）：479-482.

[18]刘海平，高华，樊星.姜黄素对过氧化氢诱导氧化损伤的黑素细胞的保护作用[J].海峡药学，2014，26（8）：129-133.

（收稿日期：2020-05-14）