菠萝洁粉蚧响应杀扑磷基因差异表达分析①

何衍彪 吴婧波 赵艳龙③

(1 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 广东湛江 524091;2 湖南人文科技学院农业与生物技术学院 湖南娄底 417000)

菠萝洁粉蚧Dysmicoccus brevipes（Cock‐ erell） 隶属于半翅目 （Hemiptera）、粉蚧科（Pseudococcidae），在世界各菠萝产区均有分布［1-3］。菠萝洁粉蚧是菠萝重要病害—菠萝凋萎病的主要传播媒介，已在国内外引起广泛关注［4-6］。化学防治是控制菠萝洁粉蚧的重要措施，种苗浸泡处理效果尤其明显［7］。杀扑磷（methidathion）又名速扑杀，由瑞士汽巴嘉基公司开发的广谱、高效有机磷农药，具有较强的触杀和胃毒作用，是园林植物、果树等经济作物介壳虫常见的防治药剂［8］。有机磷类杀虫剂进入生物体后，所发生的生物转化主要是初级代谢中的氧化反应和水解反应，以及一些次级代谢（轭合代谢），这些代谢需要细胞色素P450 酶系（P450s）、羧酸酯酶（CarEs）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）等解毒酶的参与［9-10］。

转录组学（transcriptomics）是从整体转录水平系统研究基因转录图谱并揭示复杂生物学通路和性状调控网络分子机制的学科［11］。转录组测序技术（RNA-Seq）可以全面快速地获取某一物种个体、特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，反映出它们的表达水平，是分析生物对不同外部环境分子响应机制的重要手段。鉴于菠萝洁粉蚧目前无公布基因组图谱，本研究采用RNA-seq 高通量测序的方法分别对清水处理和杀扑磷药液处理的菠萝洁粉蚧的转录组进行了测序，并利用生物信息学的方法对所得unigene进行功能注释和功能分类，以便获得杀扑磷药剂处理和非处理的菠萝洁粉蚧转录组信息，研究菠萝洁粉蚧在转录水平上对有机磷杀虫剂的响应，为深入研究昆虫的解毒机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫：在广东省农垦丰收糖业发展有限公司菠萝生产基地，从植株根部采集菠萝洁粉蚧，用“南瓜＋蛭石”的方法进行室内饲养［3］；动物RNA提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

参照何衍彪［12］毒力测定结果，分别取致死中浓度（LC50）药液和清水浸泡30 s 的菠萝洁粉蚧雌虫50 头（2 龄若虫、成虫各25 头），用滤纸吸干虫体表面的水分，24 h 后置于液氮中，用动物RNA 提取试剂盒提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后，将样品管置于干冰中送广州基迪奥生物科技有限公司测序。

1.2.2 cDNA文库构建和转录组测序

用带有Oligo（dT）的磁珠富集样品mRNA，向得到的mRNA 中加入Fragmentation Buffer 使其片断化，再以片断化的mRNA 为模板，用六碱基随机引物合成cDNA 第一链，随后通过DNA 聚合酶I、RNase H、dNTPs 及缓冲液合成cDNA 第二链，再用QiaQuick PCR 试剂盒纯化，加EB 缓冲液洗脱，经末端修复、加碱基A、连接序接头，最后用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段并进行PCR扩增。建好的文库用Illumina HiSeqTM4000进行测序。

1.2.3 序列组装与功能注释

按照无参考基因组的样本进行分析。用Trinity 软件将过滤后的reads 拼接成转录本，转录本去冗余后得到Unigene；利用blastx将组装出来的 Unigene 序列与 Nr、SwissProt、KOG 和 KO 四个数据库进行比对，以每个Unigene在数据库中相似度最高的那一条序列为对应的同源序列，并确定同源序列所属物种，统计比对到各个物种的同源序列数量［13］。

1.2.4 差异表达基因分析

根据样本基因表达水平，利用EdgeR软件进行基因差异表达分析，筛选受杀扑磷诱导表达的基因（判断标准为伪发现率小于0.05，差异倍数两倍以上）。然后对差异表达基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析［14］。

2 结果与分析

2.1 转录组测序与序列组装

构建文库用Illumina HiSeqTM4000 测序，杀扑磷药液处理组（NN-Y）和对照组（NN27）测序分别获得9.30 G 和10.04 G 数据量，GC 含量分别为39.17%和39.22%，其Q30（错误率小于0.1%的碱基占比）分别为94.98%和94.99%。对测序得到的高质量数据进行de novo组装，获得了52 806 Unigene （其 中 15 890 个 Unigene 在 Nr、 Swis‐sProt、KOG和KO四个数据库中有注释），平均长度分别为1 007 bp，N50为2 270 bp。

2.2 差异表达基因分析

通过差异表达基因数据分析，与清水处理的对照组（NN27）相比，杀扑磷药液处理组（NN-Y）中共发现8 389 个差异基因（DEGs），其中表达量上调的有3 068 个，下调的有5 321 个（图1）。与抗逆、解毒相关的差异表达基因中，下调的基因数量明显多于上调的基因数量。其中乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase）相关差异表达基因下调和上调的基因数量分别为4 个和1 个，细胞色素P450（Cytochrome P450）相关差异表达基因下调和上调的基因数量分别为25 个和11 个，羧酸酯酶（Carboxylesterase）相关差异表达基因下调和上调的基因数量分别为12 个和3 个，谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase）相关差异表达基因下调的基因数量和上调的基因数量分别为13个和4个（表1）。

表1 部分与抗逆、解毒相关的差异表达基因

续表1 部分与抗逆、解毒相关的差异表达基因

2.3 差异表达基因富集分析

Gene Ontology 中生物学可以分为生物学过程（biological process）、 细 胞 组 分 （cellular component）和分子功能（molecular function）3部分，某一差异基因可能同时属于多个功能类别。富集分析发现，差异表达基因中参与生物学过程的差异基因有1 125 个，其中参与细胞和新陈代谢过程、单组织过程的差异基因所占比例较高；参与细胞组分的差异基因有552个，其中细胞、细胞组分、细胞膜的差异基因所占比例较高，其余组分比例较低；参与分子功能的差异基因有722 个，大多数表现为结合和催化活性。生物学过程、细胞组分和分子功能三部分下调的差异基因数量分别为811 个、436 个和501 个，下调的差异基因数量明显多于上调差异基因数量（图2）。

对NN27、NN-Y 两个种群样本差异表达基因进行KEGG 代谢通路富集分析，发现在脂肪酸代谢（Fatty acid metabolism）、淀粉与蔗糖的代谢（Starch and sucrose metabolism）、 溶 酶 体（Lysosome）、甘油酯代谢（Glycerolipid metab‐olism）、神经活性配体受体相互作用（Neuroac‐tive ligand-receptor interactiom）和类固醇生物合成（Steroid biosynthesis）等代谢通路显著富集（图3）。

与清水处理的对照组（NN27）相比，杀扑磷药液处理组（NN-Y）关于类固醇生物合成通路上调和下调的差异基因分别为34 个和3 个，关于神经活性配体受体相互作用通路上调和下调的差异基因分别为28 个和1 个，关于甘油酯代谢通路上调和下调的差异基因分别为34 个和2 个，关于溶酶体通路上调和下调的差异基因分别为9 个和39个，关于淀粉与蔗糖的代谢通路上调和下调的差异基因分别为13 个和27 个，关于脂肪酸代谢上调和下调的差异基因分别为10个和18个。

3 讨论

转录组分析为挖掘昆虫功能基因提供了有效方法，促进了昆虫食性转化、生理适应、协同进化等分子机制研究［15］。本研究利用RNA-Seq 高通量测序技术，研究了杀扑磷药液处理和清水处理菠萝洁粉蚧的差异表达基因，并对差异基因的蛋白的分类、功能及代谢通路做了初步的解析。发现参与分子功能的基因大多体现在结合和催化活性方面，在脂肪酸代谢、淀粉与蔗糖的代谢、溶酶体、甘油酯代谢、神经活性配体受体相互作用和类固醇生物合成等代谢通路显著富集。

与清水处理组相比，杀扑磷药液处理组菠萝洁粉蚧表达量下调的总差异基因数明显多于表达量上调的与乙酰胆碱酯酶、细胞色素P450、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶等抗逆、解毒相关的下调的差异表达基因数也明显多于上调基因的，但关于类固醇生物合成和神经活性配体受体相互作用通路中上调差异表达基因数明显多于下调基因。

昆虫对杀虫剂的应激反应有助于昆虫抗药性的研究，但昆虫对杀虫剂的应激反应有别于昆虫抗药性，是昆虫在短时间内的一种动态反应，而昆虫抗药性是在长期的自然选择过程形成的对杀虫剂的适应性。前人研究发现，昆虫对杀虫剂的应激反应跟杀虫剂的处理剂量有关。乙酰胆碱酯酶活性随甲维盐处理剂量增加时，对斑翅果蝇和黑腹果蝇成虫体内乙酰胆碱酯酶的活性均具有一定的抑制作用，低剂量甲维盐处理斑翅果蝇成虫后，乙酰胆碱酯酶活性明显升高［16］。本研究中乙酰胆碱酯酶等相关抗逆、解毒基因表达量以下调为主，这可能与以致死中浓度（LC50）杀扑磷药液浸泡30 s 的处理方式有关。杀扑磷对菠萝洁粉蚧处理时间相对较长，使菠萝洁粉蚧得以与杀扑磷药液充分接触，导致试虫承载的药剂剂量相对较高。杀扑磷药液浸泡处理不同时间对菠萝洁粉蚧相关基因应激反应的影响有待于进一步研究。