尼莫地平对大鼠星形胶质细胞β淀粉样蛋白转运功能的影响及可能机制▲

刘 洁 米亚静

(西安医学院基础医学部细胞与遗传教研室，陕西省西安市 710021，电子邮箱：1181418262@qq.com)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种常见的神经系统变性疾病，主要临床表现为慢性、进行性加重的认知功能障碍，是老年期痴呆最常见的类型[1]。AD的主要病理变化为细胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)异常聚集形成淀粉样斑块，神经元内微管相关蛋白Tau过度磷酸化形成神经原纤维缠结，以及神经元和突触变性或丢失[2-3]。目前，AD的病因和发病机制尚未明确，缺乏有效治疗手段[4]。研究表明，蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)活性的抑制、海马组织糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)表达的增加与微管相关蛋白Tau的过度磷酸化密切相关[5]；敲除成对免疫球蛋白样受体B蛋白(paired immunoglobulin-like receptor B，PirB)基因或阻断其表达，能促进脊髓损伤动物的神经再生，并缓解Aβ对AD的影响[6]；促进低密度脂蛋白相关受体1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP-1)表达有助于Aβ经血脑屏障外流[7]。尼莫地平是第二代二氢吡啶类钙通道阻滞剂，因具有脂溶性高等特点[8]，目前已被广泛应用于治疗脑出血、蛛网膜下腔出血等脑血管疾病。本研究通过共培养大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC)与大鼠星形胶质细胞(astrocyte,Ast)建立体外血脑屏障模型，探讨不同浓度尼莫地平对血脑屏障模型的Aβ转运功能、PP2A活性和蛋白表达以及兔抗鼠晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)、LRP-1、PirB、GSK3β、磷酸化Tau(phosphorylated Tau,p-Tau)蛋白表达的影响，并分析其作用机制，以期为临床上更好地治疗和控制AD提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠Ast、大鼠BMEC、动物Ast培养基、内皮细胞培养基均购自上海中乔新舟生物科技有限公司(批号：R1800、R1000、1831、1021)。Aβ1-42多肽购自苏州强耀生物科技有限公司(批号：04010011827)；尼莫地平注射液购自山东新华制药股份有限公司(国药准字H10950226)；V2460试剂盒购自上海抚生实业有限公司(批号：FS-ELISA-12595，规格：96T/48T)；二甲基亚砜、LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β单克隆抗体购自美国Sigma公司(批号：SIGMAD2650、RAB2984、RAB3015、RAB3409、RAB3145、RAB2973、RAB3047)；β-肌动蛋白一抗购自北京百奥莱博科技有限公司(批号：20161220)；聚偏二氟乙烯膜购上海生工生物工程有限公司(批号：F619537)；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗购自上海生工生物工程有限公司(批号：D110098)；蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒购自美国Thermo公司(批号：C510003、C503021)；蛋白凝胶成像仪购自Bio-Rad公司(型号：Gel Doc XR+)；Transwell装置(孔径3.0 μm)购自北京萌壮科技有限公司(批号：3415)；Aβ1-42多肽酶联免疫吸附测定试剂盒、荧光素-葡聚糖4000(fluorescein-dextran 4000，FD4)及六氟异丙醇均购自Sigma公司(批号：RAB1864、RAB1832、RAB1609)；三气培养箱购自北京美华仪科技有限公司(型号：MHY-29976)；Millicell-ERS电阻仪购自北京明阳科华生物科技有限公司(型号：MERS00002)；荧光分光光度计购自天津良益科技有限公司(型号：LYF-300)。

1.2 实验方法

1.2.1 体外血脑屏障模型的建立：参照文献[9]利用Transwell装置共培养Ast和BMEC，建立体外血脑屏障模型。将Ast调整为3×104个/cm2后种植在涤纶膜下层，便于细胞终足充分形成，2 d后将BMEC调整为4×104个/cm2后种植在涤纶膜上层。BMEC侧为血管侧，Ast侧为脑侧。使用显微镜观察到细胞融合后，用Millicell-ERS电阻仪测定跨膜电阻，当跨膜电阻达到(300±13.6)Ω/cm2时，提示体外血脑屏障模型建立成功。

1.2.2 Aβ1-42工作液的制备：参照文献[10]制备Aβ1-42工作液。将1 mg Aβ1-42多肽溶于1 mL六氟异丙醇溶液中，充分溶解后，化学通风橱内自然风干。将风干物在100%二甲基亚砜中重悬配成1 mmol/L储存液，于-80℃冰箱中储存，临用前用动物Ast培养基稀释成工作液，终浓度为2 μmol/L。

1.2.3 药物处理：利用上述已建好的体外血脑屏障模型，Ast组(设为对照组)用动物Ast培养基于37℃、5% CO2下培养48 h，收集细胞备用；低、中、高浓度尼莫地平+Ast组分别加入含终浓度为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L的尼莫地平动物Ast培养基，于37℃、5% CO2下培养24 h，更换新鲜动物Ast培养基继续于37℃、5% CO2下培养24 h，收集各组Ast备用。

1.2.4 跨膜电阻及FD4通透性的检测：(1)各组细胞按1.2.3处理后24 h，加入新鲜的动物Ast培养基。用Millicell-ERS电阻仪测定跨膜电阻值，减去无细胞的共培养池涤纶膜的跨膜电阻值，即得出细胞层跨膜电阻值。实验重复6次。(2)各组细胞按1.2.3处理后，将含终浓度为10 μmol/L FD4的动物Ast培养基置于脑侧作用60 min，收集血管侧培养基，置于荧光分光光度计专用96孔板，于激发波长480 nm、发射波长520 nm处测量，根据标准曲线计算FD4浓度。实验重复6次。

1.2.5 Aβ跨血脑屏障模型转运率的测定：取1.2.3各组细胞，脑侧添加含2 μmol/L Aβ1-42多肽的Ast培养基，血管侧添加普通培养基。37℃、5% CO2下培养60 min后，取50 μL血管侧培养基，采用Aβ1-42多肽酶联免疫吸附测定试剂盒检测血管侧培养基中Aβ1-42多肽含量。实验重复6次。

1.2.6 PP2A活性的检测：取1.2.3各组细胞，采用V2460试剂盒检测各组细胞中PP2A活性，操作步骤严格按照说明书进行。实验重复6次。

1.2.7 Ast细胞RAGE、LRP-1、PirB、PP2A、GSK3β、p-Tau蛋白表达的检测：按照蛋白提取试剂盒说明书提取1.2.3各组Ast细胞中的总蛋白，采用二喹啉甲酸蛋白试剂盒测定各组Ast细胞总蛋白含量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量蛋白质，将蛋白质转聚偏二氟乙烯膜上，添加LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β、β肌动蛋白一抗(1 ∶500)，4℃冰箱孵育过夜。磷酸缓冲液洗涤后添加辣根过氧化物酶标记的二抗(1 ∶5 000)，常温下孵育2 h。采用Tanon 600图像分析系统对LRP-1、RAGE、P-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白水平进行定量分析。实验重复6次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 尼莫地平对血脑屏障模型完整性的影响 4组的跨膜电阻和FD4通透性比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 4组血脑屏障模型完整性相关指标比较(x±s)

2.2 尼莫地平对Aβ跨血脑屏障模型外向转运的影响 Ast组、低浓度尼莫地平+Ast组、中浓度尼莫地平+Ast组、高浓度尼莫地平+Ast组Aβ跨血脑屏障模型外向转运依次增多(均P<0.05)。见表2。

表2 4组Aβ跨血脑屏障模型外向转运情况比较(x±s，pg/mg)

2.3 尼莫地平对Ast细胞中PP2A活性的影响 Ast组、低浓度尼莫地平+Ast组、中浓度尼莫地平+Ast组、高浓度尼莫地平+Ast组Ast细胞中PP2A活性依次升高(均P<0.05)。见表3。

表3 4组Ast的PP2A活性比较[x±s，pmol/(g·min)]

2.4 尼莫地平对Ast细胞中LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白表达的影响 Ast组、低浓度尼莫地平+Ast组、中浓度尼莫地平+Ast组、高浓度尼莫地平+Ast组Ast中的LRP-1、PP2A蛋白相对表达水平依次升高，RAGE、p-Tau、PirB、GSK3β蛋白相对表达水平依次降低(均P<0.05)。见表4、图1。

表4 4组Ast中LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白相对表达水平比较(x±s)

图1 4组Ast中LRP-1、RAGE、p-Tau、PP2A、PirB、GSK3β蛋白表达情况

3 讨 论

AD是临床常见的退行性疾病，发病与年龄密切相关，发病人群以60岁以上老人为主[7]。随着我国人口老龄化进程加速，AD发病率逐年升高，65岁以上人群AD发生率为13%，85岁以上人群AD发病率则高达45%，预计到2050年世界范围内将有超过8 000万人遭受AD困扰[11]，这给社会带来沉重负担。Aβ是由39～42个氨基酸构成的短肽，为淀粉样前体蛋白的水解产物，其是AD发病的主要影响因素[12]，但具体的作用机理尚未完全阐明。本研究结果显示，Ast组、低浓度尼莫地平+Ast组、中浓度尼莫地平+Ast组、高浓度尼莫地平+Ast组Aβ跨血脑屏障模型外向转运依次增多(均P<0.05)，呈剂量依赖性，另外4组的跨膜电阻、FD4通透性差异无统计学意义(P>0.05)，即各浓度尼莫地平均不影响血脑屏障模型的完整性，因此血管侧Aβ1-42多肽含量增多并非因血脑屏障破坏导致Aβ漏出所致，这提示尼莫地平在一定程度可促进Aβ外向转运，减少Aβ在脑内的沉积。

研究显示，在AD早期Ast被持续、广泛激活[13]。激活的Ast可结合、摄取并降解胞外Aβ，从而减少Aβ在细胞外的沉积[14]。大脑中存在多种受体可介导Aβ转运，其中RAGE作为一种多配体受体，可与Aβ结合，促使Aβ穿过血脑屏障进入大脑并积聚；LRP-1作为清道夫受体，可帮助Aβ经血脑屏障外流，在Aβ清除过程中发挥重要作用[7]。RAGE、LRP-1作为一对重要的逆向转运体，在维持脑Aβ平衡中发挥关键作用：LRP-1水平升高、RAGE水平降低会促进Ast中Aβ外向转运，抑制Aβ内向转运，可促进AD发病[15]。但具体作用机制尚不清楚。本研究结果显示，Ast组、低浓度尼莫地平+Ast组、中浓度尼莫地平+Ast组、高浓度尼莫地平+Ast组Ast中LRP-1蛋白表达依次升高，RAGE蛋白表达依次降低(均P<0.05)。这提示尼莫地平可剂量依赖性地上调星型胶质细胞中LRP-1蛋白表达，下调RAGE蛋白表达，从而促进Aβ跨血脑屏障模型的外向转运，减少Aβ在Ast内的沉积，表明尼莫地平可能对AD患者具有一定的治疗作用。

AD的主要病理特征包括细胞外Aβ沉积形成神经炎性斑，以及细胞内Tau蛋白磷酸化、聚集形成神经元纤维缠结[16]。研究表明，脑内Aβ沉积可增加Tau蛋白过度磷酸化，引起脑内神经元纤维缠结大量形成，进而引发AD[17]。GSK-3β、PP2A是与AD发病密切相关的两种蛋白磷酸酶[18]，降低PP2A蛋白表达，可增加GSK3β活性[19]，进而加剧Aβ在胞内沉积[20]。研究显示，逍遥散可上调PP2A蛋白表达、下调GSK-3β蛋白表达，抑制可溶性Aβ前体蛋白在神经元内的沉积[17]，阻止AD进程。PirB是一种免疫球蛋白样受体，可通过与Aβ结合，减少胞浆PP2A蛋白表达，激活GSK3β，进而增加Aβ在胞内的沉积[21]。本研究结果显示，Ast组、低浓度尼莫地平+Ast组、中浓度尼莫地平+Ast组、高浓度尼莫地平+Ast组Ast中PP2A活性及其蛋白表达依次升高，p-Tau、PirB、GSK3β蛋白表达依次降低(P<0.05)，提示尼莫地平可上调Ast中PP2A蛋白表达并促进其活化，同时下调p-Tau、GSK3β、PirB蛋白表达，从而抑制Aβ在Ast内的沉积，抑制Tau蛋白过度磷酸化，推测尼莫地平可能是通过减少神经炎性斑及神经元纤维缠结的形成，阻碍AD进展。

综上所述，尼莫地平可提高Ast中Aβ的转运能力，减少Tau蛋白磷酸化，其机制可能与其下调RAGE、PirB、GSK3β表达，促进PP2A、LRP-1蛋白表达有关。