北五味子提取物对糖尿病大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 表达的影响

曲萌 ,于春艳 ,翁诗雅,高润泽,王珍霞,宋宇,李旭甡,郑鸿,尹含钰,董志恒

（1.北华大学医学院生物化学与分子生物学教研室，吉林 吉林 132013；2.北华大学医学院病理学教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林省长春市中心医院老年病科，吉林 长春 130051）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是独立于高血压和冠心病等已知心脏疾病的糖尿病患者的一种特异性心肌结构与功能的异常，以心肌肥大、纤维化、缩舒功能障碍和心力衰竭为其主要特征，现已成为糖尿病患者致死致残的主要原因［1-3］。研究［4-5］表明：DCM 的发病是糖脂代谢紊乱及其氧化应激和细胞因子活化等多种因素综合作用的结果，其中氧化应激（oxidative stress，OS）在DCM 的发生发展中起着重要作用。OS 是指机体氧化系统和抗氧化系统之间失衡，机体内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等高活性分子生成过多，进而导致组织损伤的一种状态［6］。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是由催化亚基和调控亚基组成的酶复合体，是体内ROS 的重要来源，降低NADPH 氧化酶活性，抑制OS 反应是防治DCM 的有效方法［7］。北五味子为木兰科植物五味子的成熟果实，含有木脂素、多糖、皂苷和黄酮等多种成分，具有收敛固涩、益气生津和补肾宁心等作用。近年来随着对北五味子化学成分和药理作用深入研究及开发利用，其降血脂、抗血小板聚集和抗氧自由基等作用逐渐成为学者们研究与开发的热点［8-9］，而有关五味子及其提取物对DCM 影响的报道较少。本研究旨在观察糖尿病大鼠心肌组织OS 水平，并采用不同剂量北五味子提取物（Schisandrae Chinensisextracts，SCE）进行干预，探讨SCE 对糖尿病大鼠心肌OS 水平的影响及其心肌保护作用，为进一步研究北五味子的药效和药物作用机制提供实验依据，也为DCM 的临床防治提供新的靶标和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器6 周龄清洁级健康雄性Wistar 大鼠59 只，体质量（210±20）g，由吉林大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（吉）2007-0003。实验期间，室温控制在（19±1）℃，湿度48%，所有大鼠均单笼饲养，自由饮食水。SCE 由吉林大学药学院提供（每克提取物中含五味子甲素0.3 mg 和五味子乙素0.4 mg），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司），肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）测试盒（上海华臣生化试剂有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽激酶（GSH）测试盒（南京建成生物工程研究所），荧光实时定量PCR 试剂盒（日本TaKaRa 公司），NADPH 氧化酶亚单位NOX2 和p47phox 及内参引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，鼠抗NOX2、p47phox、β-actin 抗体和羊抗鼠二抗及增强发光（ECL）试剂盒（美国Santa Cruz 公司），其他试剂均为国产分析纯。日立7150 全自动生化分析仪（日本日立公司），ABI 实时定量PCR 扩增仪（美国应用生物系统公司），电泳仪、转膜仪和凝胶成像仪（美国Biobad 公司）。

1.2 糖尿病大鼠模型的制备、实验动物分组及给药所有大鼠适应性喂养1 周，空腹血糖（FBG）均正常。随机选取其中49 只大鼠禁食12 h 后，在空腹状态下，按55 mg·kg－1腹腔单次注射STZ（临用前溶于0.1 mol·L－1、pH4.2 无菌柠檬酸盐缓冲液中，终浓度为2%），分别于注射3 和7 d 后，鼠尾静脉取血测定FBG 及尿糖定性，连续3 次FBG≥16.7 mmol·L－1，尿糖定性≥+++，且伴有多饮、多食和多尿者确定为糖尿病模型大鼠。除去4 只因FBG 急骤升高而死亡的大鼠，剩余45 只大鼠造模成功并纳入实验。同时设立正常对照组（n＝10），仅腹腔注射等体积的无菌柠檬酸盐缓冲液。造模成功的大鼠随机分 4 组： 模型组（n＝12）、低剂量SCE 组（n＝11）、中剂量SCE 组（n＝11）和高剂量SCE 组（n＝11）。低、中和高剂量SCE 组分别给予100、200 和400 mg·kg－1的SCE 混悬液灌胃，正常对照组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃，每天1 次。每周称体质量1 次，调整用药剂量，持续观察12 周。实验期间所有大鼠未使用胰岛素治疗。

1.3 标本留取12 周末，各组大鼠禁食，称体质量，按3 mL·kg－1剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉。在无菌条件下腹主动脉取血，分离血清用于测定FBG 和心肌酶水平。剪取心脏，冰生理盐水冲洗后，滤纸拭干，剪去心房和右心室游离壁，称取左心室质量，用于计算左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）（LVMI＝左心室湿质量／体质量）。取左心室心尖部组织固定于10%中性甲醛，常规脱水、浸蜡和包埋，制成4 μm厚度切片，用于HE 染色。剩余左心室组织置于－80℃冰箱保存，待测心肌组织MDA 水平，SOD 和GSH 活性，荧光实时定量PCR 法检测各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平，Western blotting 法检测各组大鼠心肌组织中NOX2和p47phox 蛋白表达水平。

1.4 实验室指标检测应用全自动分析仪检测FBG 和心肌损伤标志物（CK 和LDH）水平。采用比色法测定心肌组织中MDA 水平及SOD 和GSH活性，采用考马斯亮蓝法测定组织蛋白水平。所有测定步骤严格按照试剂说明书操作。

1.5 实时荧光定量PCR 法检测大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平Trizol 法提取心肌组织总RNA，逆转录合成cDNA，应用实时荧光定量PCR 仪进行扩增反应，反应总体积20 μ L，反应条件：95℃预变性10 min，（95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s）×40 个循环，每个样本设 6 个复孔。NOX2： 上游引物 5'-GTGTGTGAATGCCAGAGTCG-3'，下游引物5'-TTCAAAGTAAGACCTCCGAATGG-3'p47phox：上游引物5'-TCAGAATGTTGCCTGGTTGGT-3'，下游引物5'-GCCGACCTTGAACGTAACAG-3'；β-actin：上游引物5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'，下游引物5'-GGGTACATGGTGGTGCCG-3'。采用2－ΔΔCt法（ΔΔCt=试验样品ΔCt－基准样品ΔCt）计算各组心肌组织中目的基因mRNA 表达水平；若2－ΔΔCt＞1，提示目的基因表达水平升高；若2－ΔΔCt＜1，提示目的基因表达水平降低。

1.6 Western blotting 法检测大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达低温提取大鼠心肌组织蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。每孔上样50 μg 蛋白，10% SDS-PAGE 电泳分离样品，转膜，封闭，分别滴加β-actin（1∶2 000）、NOX2（1∶200）和p47phox（1∶200）一抗，4℃过夜。洗膜，滴加二抗（1∶2 000），37℃孵育2 h，洗膜；与ECL 发光反应液反应，化学发光成像系统显色并分析各条带灰度值。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。

1.7 统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠血清中FBG、CK 和LDH水平，LVMI，心肌组织中MDA 水平，SOD 和GSH 活性，心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA及蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况、血清FBG、心肌酶水平及LVMI实验期间，正常对照组大鼠身体状况和精神状态良好，未发生死亡；模型组大鼠早期多动，后期反应迟钝，精神萎靡，动作迟缓，体瘦背弓，毛竖而无光泽，多饮、多食和多尿症状明显，体质量减轻，部分大鼠出现尾和趾溃烂，皮下脓肿及白内障等症状。与模型组比较，低、中和高剂量SCE 组大鼠饮水量、食量和尿量均明显减少，精神状态、行动及毛色、体态均有所好转，尤其是高剂量SCE 组最为明显。除正常对照组外，其余各组大鼠均有死亡，其中模型组4 只大鼠和低剂量SCE 组2 只大鼠因FBG 过高或感染死亡；高剂量SCE 组1 只大鼠死于胸部皮下感染；低、中和高剂量SCE 组各有1 只大鼠死于灌胃窒息。

与正常对照组比较，各组糖尿病大鼠FBG 水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，低、中和高剂量SCE 组大鼠FBG 均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈一定的剂量依赖性。各组糖尿病大鼠心肌损伤标志物CK 和LDH 水平及LVMI 均明显高于正常对照组（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，各剂量SCE 组大鼠血清中CK 和LDH 水平及LVMI 均有不同程度降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中高剂量SCE 组大鼠CK 和LDH 水平及LVMI 降低最明显。见表1。

表1 各组大鼠血清中FBG、CK、LDH 水平及LVMITab.1 Levels of FBG,CK,LDH in serum and LVMI of rats in various groups(）

表1 各组大鼠血清中FBG、CK、LDH 水平及LVMITab.1 Levels of FBG,CK,LDH in serum and LVMI of rats in various groups(）

*P＜0.05，**P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsmodel group.

2.2 各组大鼠心肌组织病理形态表现HE 染色结果显示：正常对照组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核明显，大小较均匀。模型组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞核周围可见空泡性病变，核固缩增多，细胞坏死，纤维化，局部可见炎细胞浸润。与模型组比较，低、中和高剂量SCE 组大鼠心肌组织中上述病理变化均有不同程度的改善，见图1。

2.3 各组大鼠心肌组织中OS 相关因子水平与正常对照组比较，12 周末模型组和低、中及高剂量SCE 组大鼠心肌组织中MDA水平明显升高（P＜0.05），SOD 和GSH 活性明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，低、中和高剂量SCE 组大鼠心肌组织中MDA 水平明显降低（P＜0.05），SOD 和GSH 活性明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），其中高剂量SCE 组干预效果更明显。见表2。

2.4 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平12 周末，模型组和低、中及高剂量SCE 组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平较正常对照组明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，低、中和高剂量SCE 组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）；高剂量SCE 组降低效果更明显。见表3。

2.5 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达水平12 周末，与正常对照组比较，模型组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，低、中和高剂量SCE 组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中高剂量SCE 组降低效果更明显。见表4 和图2。

表2 各组大鼠心肌组织中MDA 水平和SOD 及GSH 活性Tab.2 Levels of MDA and activities of SOD and GSH in myocardium tissue of rats in various groups()

表2 各组大鼠心肌组织中MDA 水平和SOD 及GSH 活性Tab.2 Levels of MDA and activities of SOD and GSH in myocardium tissue of rats in various groups()

*P＜0.05，**P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsmodel group.

表3 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of NOX2 and p47phox mRNA in myocardium tissue of rats in various groups()

表3 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of NOX2 and p47phox mRNA in myocardium tissue of rats in various groups()

*P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.01vsmodel group.

表4 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of NOX2 and p47phox proteins in myocardium tissue of rats in various groups()

表4 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of NOX2 and p47phox proteins in myocardium tissue of rats in various groups()

*P＜0.01vsnormal control group；△P＜0.05，△△P＜0.01vsmodel group.

3 讨论

图2 各组大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoretogram of expressions of NOX2 and p47phox proteins in myocardium tissue of rats in various groups

DCM 是糖尿病常见慢性并发症之一，是一种独立的特异性心肌损伤，主要表现为心肌细胞代谢紊乱、心肌间质纤维化并伴有心脏微血管病变，最终引起左室壁肥厚，心脏舒缩功能减退。本研究采用单次腹腔注射STZ 制备糖尿病模型，造模大鼠FBG 水平明显升高，出现多饮、多食和多尿及体质量减轻症状，表明糖尿病模型建立成功。本研究结果显示：模型组大鼠LVMI 增加，血清中心肌酶CK 和LDH 水平明显升高，心肌细胞胞质出现空泡变，核固缩增多，间质纤维化，表明12 周末糖尿病大鼠已出现明显的心肌损伤；而经SCE 干预后，上述表现均有不同程度改善，尤其是高剂量SCE 组，提示SCE 可降低FBG 水平，减轻糖尿病模型大鼠心肌组织的异常变化，具有良好的心肌保护作用。

DCM 发病机制复杂，越来越多的研究［10-11］证实：高血糖所诱导的OS 是糖尿病心血管慢性并发症发病进程中的高危险因素。研究［12］表明：高血糖可导致线粒体功能紊乱，产生过量的过氧化物，继而诱导心肌细胞代谢障碍，引起心肌肥厚和间质纤维化，因此糖尿病大鼠体内ROS 的增多是引起糖尿病心肌损伤的一个重要促发因素。NADPH 氧化酶是体内组织细胞ROS 的主要来源，主要由位于细胞膜的p22phox 和gp91phox、胞质的p47phox及p67phox 构成［13-14］。NOX 是催化亚基gp91phox的同源物，广泛存在于多种非吞噬细胞，主要包括NOX 1～5、Duox1 和Duox2，是线粒体外ROS 的主要来源［15］。研究［16-17］证实：NOX 亚单位NOX2和p47phox 的活化对NADPH 氧化酶产生ROS 起着至关重要的作用。NADPH 氧化酶的激活及其组成亚基的表达上调参与了糖尿病心血管并发症的发生［18］。研究［19］显示：糖尿病动物模型体内氧自由基损伤组织的重要标志物MDA 水平早期明显升高，12 周可达到最高水平。与此同时，体内还存在抗氧化损伤的防御系统，其中SOD 和GSH 是体内清除ROS 的主要抗氧化酶，SOD 可将体内氧自由基转化成H2O2，后者在过氧化氢酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的作用下再转变成H2O，进而消除氧自由基对机体组织的损伤［20］。本研究结果显示：12 周末，糖尿病大鼠心肌组织中NOX2和p47phox mRNA 及蛋白表达水平上调，MDA 水平升高，抗氧化酶SOD 和GSH 活性明显下降，表明在长期高血糖环境下，糖尿病大鼠心肌组织氧化作用增强，抗氧化作用降低，氧化和抗氧化系统失衡，导致ROS 大量蓄积，OS 水平增强，进而造成脂类等生物大分子氧化损伤，导致脂质过氧化终产物MDA 水平升高，提示糖尿病高血糖状态下心肌损伤的发生与心肌组织OS 水平增强有关，NOX2和p47phox 的活化在DCM 的发生发展中起重要的作用。

北五味子主产于我国东北地区，是长白山特产的常用中药材，具有改善血液循环、增强免疫力、抗衰老和抗氧化等作用［21-23］。本研究结果显示：SCE 干预12 周，可以明显降低糖尿病大鼠心肌组织中NOX2 和p47phox mRNA 及蛋白表达水平，增加SOD 和GSH 活性，降低MDA 水平，且存在一定的剂量依赖性，表明SCE 是通过调控心肌组织OS 水平而在DCM 发展进程中发挥作用。

综上所述，SCE 可能通过降低FBG、抑制糖尿病模型大鼠心肌组织中NADPH 氧化酶表达，增加抗氧化酶活性，降低心肌OS 水平，进而对糖尿病大鼠心肌起到保护作用，但其具体有效成分的作用以及对细胞外信号通路的影响尚有待进一步研究。