LncRNA CCAT1 通过TGF-β/Smad 信号通路对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

魏旭静,李林,张红真,王景,徐静

（河北医科大学第一医院产科，河北 石家庄 050000）

子宫内膜癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病机制复杂，探讨其发生发展机制对其诊治及改善其预后具有重要价值。近年来，子宫内膜癌细胞增殖、侵袭迁移及其分子机制方面的研究取得了巨大进步，长链非编码核糖核酸（long non coding RNA，LncRNA）在胚胎发育、基因表达和肿瘤发生等过程中发挥重要作用，多种LncRNA 参与子宫内膜癌的发生发展过程［1］。近年来研究［2］发现：LncRNA CCAT1 在多种恶性肿瘤的增殖和侵袭迁移过程中发挥重要作用，在子宫内膜癌中的作用也受到研究者关注，YU 等［3］研究发现：LncRNA CCAT1 可促进子宫内膜癌细胞的增殖和迁移。但其通过何种信号通路在子宫内膜癌发生发展中发挥作用尚不清楚。转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad 信号通路参与子宫内膜癌的增殖及侵袭迁移过程，SAHOO 等［4］研究显示：抑制细胞外基质介导的TGF-β 信号转导可抑制子宫内膜癌的转移。本实验通过观察沉默CCAT1 对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移及TGF-β/Smad 信号通路的影响，探讨其在子宫内膜癌中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人子宫内膜癌Ishiwaka 细胞株和正常人子宫内膜基质细胞THESC（中国科学院上海细胞库）；Lipofectamine 2000 试剂盒（美国Invitrogen 公司），CCAT1 模拟物siRNA（CCAT1-siRNA）和阴性对照模拟物siRNA（广州博锐生物科技公司），ECL 化学发光试剂盒、逆转录（RT）试剂盒、Trizol 试剂、聚合酶链反应（PCR）试剂盒、LY364947（TGF-β/Smad 抑制剂）和结晶紫（美国Sigma 公司），CCK8 试剂、胰蛋白酶和DMEM 培养基（美国BPB 公司），兔抗人增殖细胞核抗原（PCNA）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、锌指转录因子（snail）、凋亡抑制蛋白（Twist）、白细胞抑制因子2/3（Smad2/3）、磷酸化Smad 2/3（p-Smad2/3）、转化生长因子β1（TGF-β1）和兔抗人TGF-β1 单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）；Multiskan™FC 酶标仪、Applied Biosystems PCR 仪和NERL™流式细胞仪（美国赛默飞世尔科技公司），Transwell 小室（美国TaKaRa 公司）等。

1.2 细胞培养Ishiwaka 细胞和T-HESC 细胞置于DMEM（含双抗和10%胎牛血清）培养，细胞贴壁后每2 d 换液1 次，细胞生长至达80%以上融合时进行细胞传代培养。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测Ishiwaka 细胞和T-HESC 细胞中CCAT1 mRNA 表达水平取Ishiwaka 和T-HESC 细胞，加入Trizol裂解液裂解细胞，提取细胞总RNA，将RNA 逆转录为cDNA，PCR 法检测细胞中CCAT1 mRNA 表达水平；CCAT1上游引物：5'-CCATTCCATTCATTTCTCTTTCCTA-3'，下游引物：5'-GGCGTAGGCGATTGGGGATCG-3'。PCR 反应条件：95℃、30 s；95℃、5 s，58℃、30 s，72℃、30 s，共42 个循环。以U6 为内参照。每组设7 个复孔。以2－ΔΔCt法计算细胞中CCAT1 mRNA 表达水平。

1.4 细胞分组和转染取对数生长期的Ishiwaka细胞分为空白对照组、阴性对照组、CCAT1-siRNA 组和CCAT1-siRNA+LY364947 组，将各组对数生长期的Ishiwaka 细胞接种到6 孔细胞培养板中，每孔2×105个细胞，培养至细胞达90%以上融合时进行转染，阴性对照组转染阴性对照siRNA，CCAT1-siRNA 组转染CCAT1-siRNA，CCAT1-siRNA+LY364947 组转染 CCAT1-siRNA 同时加入LY364947（3 μL）［5］，空白对照组不转染。转染步骤严格参照Lipofectamine 2000 试剂盒说明书进行。转染24 h 后采用RT-PCR 法检测细胞中CCAT1 mRNA 表达水平，方法同“1.2”。

1.5 CCK8 法检测Ishiwaka 细胞增殖能力取各组生长良好的Ishiwaka 细胞接种到96 孔细胞培养板中，每孔5×103个细胞，培养24、48 和72 h 时每孔分别加入10 μL 的CCK8 试剂，继续培养2 h，每组设7 个复孔。酶标仪检测450 nm 波长处各孔吸光度（A）值，以A 值表示细胞增殖能力。

1.6 Transwell 小室实验检测各组侵袭细胞数和迁移细胞数取各组生长状态良好的Ishiwaka 细胞用双无培养基悬浮，将含血清的正常培养基加入24 孔细胞培养板中，将24 孔细胞培养板放入Transwell 小室，调整各组细胞个数，使200 μL 培养液中含5×104个细胞，将各组细胞放入Transwell 小室培养24 h，然后取出小室，甲醇固定30 min，棉签擦去内室细胞，用 结晶紫染色30 min，纤维镜下观察迁移细胞数。侵袭实验在实验前用基质胶包被小室，其余步骤同迁移实验。

1.7 Western blotting 法检测Ishiwaka 细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平取各组转染24 h 细胞加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测细胞蛋白浓度。取100 μg 蛋白电泳，经转膜、5% 脱脂奶粉封闭，加入一抗： 兔抗人PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 单克隆抗体，稀释比例1：200，过夜孵育。加入二抗（1：5 000）孵育2 h，以β-actin 为内参，化学发光法显色，每组设7 个复孔，凝胶电泳成像仪采集图像，Quantity One 软件分析条带灰度值。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带灰度值/β-actin 条带灰度值。

1.8 统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。不同细胞中CCAT1 mRNA 表达水平、各组细胞增殖能力、迁移细胞数、侵袭细胞数以及细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平经检验均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞中 CCAT1mRNA 表达水平Ishiwaka 细胞中CCAT1 mRNA 表达水平（1.94±0.17）明显高于T-HESC 细胞（1.00±0.09）（t=12.929，P＜0.01）。

2.2 各组Ishiwaka 细胞中CCAT1 mRNA 表达水平与空白对照组（1.00±0.08）和阴性对照组（0.99±0.10）比较，CCAT1-siRNA 组和CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞中CCAT1 mRNA 表达水平（0.52±0.06 和0.49±0.07）明显降低（P＜0.01），空白对照组与阴性对照组及CCAT1-siRNA 组与CCAT1-siRNA +LY364947 组Ishiwaka 细胞中CCAT1 表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组Ishiwaka 细胞增殖能力培养24 h，各组Ishiwaka 细胞增殖能力比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；培养48 和72 h，与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA组和CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞增殖能力明显降低（P＜0.05），与 CCAT1-siRNA 组比较，CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞增殖能力明显降低（P＜0.05），空白对照组与阴性对照组Ishiwaka 细胞比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组Ishiwaka 细胞增殖能力Tab.1 Proliferation rates of Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表1 各组Ishiwaka 细胞增殖能力Tab.1 Proliferation rates of Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

2.4 各组Ishiwaka 细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA 组和 CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数明显降低（P＜0.05）；与CCAT1-siRNA 组比较，CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞侵袭细胞数和迁移细胞数明显降低（P＜0.05），空白对照组与阴性对照组Ishiwaka 细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1和图2。

表2 各组Ishiwaka 细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数Tab.2 Number of invasion and migration cells in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表2 各组Ishiwaka 细胞中侵袭细胞数和迁移细胞数Tab.2 Number of invasion and migration cells in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

2.5 各组Ishiwaka 细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表达水平与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA 组和CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞中PCNA、vimentin、snail 和Twist 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与CCAT1-siRNA 组比较，CCAT1-siRNA+LY364947 组 Ishiwaka 细胞E-cadherin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），其他蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），但空白对照组与阴性对照组Ishiwaka 细胞中上述蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3和图3。

表3 各组Ishiwaka 细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of PCNA,E-cadherin,vimentin,snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

表3 各组Ishiwaka 细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of PCNA,E-cadherin,vimentin,snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in various groups(n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

图3 Western blotting 法检测Ishiwaka 细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail 和Twist 蛋白表达电泳图Fig.3 Expression levels of PCNA，E-cadherin，vimentin，snail and Twist proteins in Ishiwaka cells in virous groups determined with Western blotting method

2.6 各组Ishiwaka 细胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平与空白对照组和阴性对照组比较，CCAT1-siRNA 组和CCAT1-siRNA +LY364947 组Ishiwaka 细胞中p-Smad2/3 和TGF-β1蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与CCAT1-siRNA 组比较，CCAT1-siRNA+LY364947 组Ishiwaka 细胞中p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；空白对照组与阴性对照组Ishiwaka 细胞中p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4和表4。

图4 Western blotting 法检测Ishiwaka 细胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of Smad2/3，p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups determined by Western blotting method

表4 各组Ishiwaka 细胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of Smad2/3,p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups (n＝7，)

表4 各组Ishiwaka 细胞中Smad2/3、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of Smad2/3,p-Smad2/3 and TGF-β1 proteins in Ishiwaka cells in various groups (n＝7，)

*P＜0.05 compared with blank control group；△P＜0.05 compared with negative control group；#P＜0.05 compared with CCAT1-siRNA group.

3 讨论

LncRNA 是非编码RNA 家族成员，长度大于200 nt，不具备蛋白质编码功能，在染色质修饰、表观遗传和转录调控等多方面发挥重要调控作用，可促进蛋白基因表达，也可抑制基因表达［6］。近年来研究［7-8］显示：多种LncRNA 与恶性肿瘤的发生发展关系密切，在恶性肿瘤的发生发展中发挥抑癌或促癌作用，与靶蛋白组织的复杂的调控网络在细胞增殖、分化、凋亡和侵袭迁移中发挥重要的调控作用。LncRNA CCAT1 位于c-Myc 的一个增强子区，在多种恶性肿瘤中异常表达［9］，与多种恶性肿瘤的预后关系密切，如CCAT1 可靶向miR-219a 调节宫颈癌HeLa 细胞生长、侵袭和迁移［10］；激活CCAT1 可通过调节SPRY4 和HOXB13 在食管鳞状细胞癌中的表达影响食管鳞状细胞癌细胞增殖和迁移［11］；LncRNA CCAT1可被c-Myc 激活促进胰腺癌细胞增殖和迁移［12］。潘洪丽等［13］对子宫内膜癌细胞中LncRNA CCAT1 表达研究发现：子宫内膜癌组织中LncRNA CCAT1 呈高水平表达，沉默子宫内膜癌细胞中LncRNA CCAT1 水平可抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移。本文作者对子宫内膜癌Ishiwaka 细胞中LncRNA CCAT1 水平研究发现：Ishiwaka 细胞中LncRNA CCAT1 mRNA 表达水平升高，沉默Ishiwaka 细胞LncRNA CCAT1 表达可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。但LncRNA CCAT1 在子宫内膜癌中的作用机制尚不清楚。

多种信号通路参与子宫内膜癌的发生发展过程，其中TGF-β/Smad 信号通路为子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移过程中的重要通路之一。TGF-β/Smad 信号通路在肿瘤的发生发展中发挥抑制和促进肿瘤进展的双重作用，在恶性肿瘤的起始阶段，TGF-β/Smad 信号通路可抑制恶性肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制恶性肿瘤的发展；在恶性肿瘤的晚期，TGF-β/Smad 信号通路可促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进恶性肿瘤的进展和转移过程［14］。TGF-β/Smad 信号通路在恶性肿瘤的发生发展中，通过调节上皮间质转化（EMT）导致恶性肿瘤细胞免疫逃避、细胞转移和诱导血管生成等，促进恶性肿瘤的进展［15-16］。

LncRNA CCAT1 可通过多种信号通路参与恶性肿瘤的发生发展，如LncRNA CCAT1 通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路影响胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移过程［17］；LncRNA CCAT1 在恶性肿瘤中的作用与CCAT1 可影响恶性肿瘤细胞EMT 有关［18］；LncRNA CCAT1 通过miR-490-3p上调TGF-β 受体1 从而促进TGF-β1 诱导的卵巢癌细胞EMT［19］。LncRNA CCAT1 可通过TGF-β 诱导细胞EMT，EMT 在细胞的侵袭迁移中发挥重要作用［20］，因此推测LncRNA CCAT1 在子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移中的作用可能与TGF-β/Smad 信号通路及EMT 有关。本研究结果显示：沉默CCAT1 及加入TGF-β/Smad 信号抑制剂均可降低细胞中PCNA、E-cadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平，细胞中E-cadherin 蛋白表达水平升高。PCNA 在细胞核中合成，检测细胞中PCNA 蛋白水平可用于评价细胞的增殖状态［21］。E-cadherin 为重要的维持上皮细胞表型的细胞间黏附分子，E-cadherin 表达缺失或者表达降低是EMT 的重要标志［22］。Vimentin 为间质细胞的标志物，其水平升高也是EMT 的标志物［23］。snail 和Twist 为TGF-β/Smad 信号通路的上游转录因子，二者水平升高可促进TGF-β/Smad 信号通路激活［24-25］。p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平可反映TGF-β/Smad 信号通路状况，p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平升高表明TGF-β/Smad 信号通路激活；反之，p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白水平降低表明TGF-β/Smad 信号通路受到抑制。因此，本研究中沉默CCAT1 及加入TGF-β/Smad 信号抑制剂均可抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移，降低细胞中PCNA、Ecadherin、vimentin、snail、Twist、p-Smad2/3 和TGF-β1 蛋白表达水平，细胞中E-cadherin 蛋白表达水平升高，表明沉默CCAT1 抑制子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制可能与抑制TGF-β/Smad 信号通路激活、从而抑制子宫内膜癌细胞EMT 有关。

综上所述，沉默LncRNA CCAT1 对子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和迁移具有抑制作用，其机制可能与沉默LncRNA CCAT1 可抑制子宫内膜癌细胞TGF-β/Smad 信号通路活化从而抑制EMT有关。