不同频率电针对膜迷路积水豚鼠耳蜗形态及血浆AVP的影响

蒋丽元,史莹莺,叶恬恬,杨俊文,王欣

(1.杭州市中医院,杭州 310007;2.杭州市丁桥医院,杭州 310022;3.浙江中医药大学,杭州 310053;4.浙江省消防总队医院,杭州 310011)

梅尼埃病又称美尼尔氏综合征(Meniere’s disease, MD),是一种临床常见内耳疾病。MD好发于40～50岁中年人,以发作性眩晕、波动性感音神经性听力下降、耳鸣、耳闷胀感伴恶心、呕吐为典型的临床表现[1]。电针治疗 MD能疏通耳部气血,改善前庭及内耳功能,缓解眩晕、耳鸣症状[2]。

MD的病理基础是膜迷路积水[3]。耳蜗积水程度与MD严重程度密切相关,膜迷路积水改善是缓解MD症状的关键。笔者在前期工作中证实电针能显著减轻耳源性眩晕豚鼠膜迷路积水,改善耳蜗听功能[4],与电针治疗MD的临床效果一致。电针刺激频率是影响疗效的重要参数。在电针治疗MD的临床报道中,相应刺激参数的选择不尽相同,疗效也有差异,但对于相同针刺方法而不同刺激参数(特别是频率)的疗效比较,至今尚缺乏研究报道,电针频率选择仍缺乏统一标准。电针在镇痛方面具有频率依赖性。电针对膜迷路积水的调节作用是否也存在频率选择性,电针又是通过什么机制减轻膜迷路积水,目前尚不明确。本实验在醋酸去氨加压素诱导的膜迷路积水模型上,以耳蜗病理为主要指标,观察不同频率电针对膜迷路积水的改善作用,筛选最佳电针频率。并通过检测血浆AVP的表达变化,初步探讨电针治疗梅尼埃病的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用清洁级雄性白毛红目豚鼠,体质量为(370±30)g,由浙江中医药大学动物实验研究中心提供[SCXY(浙)2013-0060,SYXK(浙)2013-0184]。实验中对动物的所有处置均符合2006年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。实验前豚鼠适应性饲养1周。豚鼠按完全随机分为空白组、模型组、2 Hz电针组、15 Hz电针组、2/15 Hz电针组,每组8只。

1.2 试剂与仪器

醋酸去氨加压素(海南中和制药股份有限公司,批号20170701);AVP ELISA测试盒(上海江莱生物科技有限公司,批号 20190701C);华佗牌无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司,规格0.30 mm×13 mm);HANS-100 A型韩氏镇痛电针仪(南京医疗仪器厂)。

1.3 豚鼠膜迷路积水模型的建立与评价

除外空白组,其余各组采用腹腔注射醋酸去氨加压素建立膜迷路积水模型[5]。先按4 μg/kg/d给予腹腔注射,连续7 d,第8天将剂量加大为6 μg/kg/d,连续3 d,共10 d。第11天起开始干预。豚鼠膜迷路积水模型的评价以耳蜗病理切片 HE染色观察结果为标准[5]。正常情况下耳蜗前庭膜平直,与基底膜约呈45°夹角。前庭膜将基底膜以上的空间分为两部分,即前庭阶和蜗管。前庭膜构成蜗管的上界,基底膜构成蜗管的下界,血管纹构成蜗管的外侧界,前庭膜下蜗管横截面积约为前庭阶横截面积的二分之一。当蜗管中内淋巴液含量增多,使前庭膜向前庭阶方向聚拢,前庭膜膨胀隆起时,即为发生膜迷路积水,提示造模成功。本实验以R值[蜗管横截面积/(蜗管横截面积＋前庭阶横截面积)比值]定量评估耳蜗积水程度。

1.4 分组与干预

空白组常规饲养,不予治疗。模型组采取与电针组相同固定方式。各电针组于百会向前平刺 2 mm,左侧听宫直刺3 mm,接HANS-100 A型韩氏电针仪,输出电流1 mA,留针20 min,每日1次,连续治疗10 d。2 Hz电针组、15 Hz电针组、2/15 Hz电针组采用频率分别为 2 Hz、15 Hz、2/15 Hz。豚鼠“百会”“听宫”穴定位参照《实验针灸学》[6]中的描述,采用动物比较学方法定位,于颅顶骨正中处选取“百会”穴,侧面部耳屏正前方凹陷处选取“听宫”穴。

1.5 指标检测

1.5.1 一般行为学观察

观察各组豚鼠一般行为学变化,包括豚鼠的精神状态、毛发、步态、进食、体质量变化、自发活动情况、耳廓反应等一般情况。

1.5.2 血浆AVP浓度检测

干预结束后,各组豚鼠以 10%水合氯醛按300 mg/kg剂量腹腔注射行全身麻醉,采血针经心尖穿刺,快速抽取2 mL全血置于肝素钠抗凝管中。全血于4℃3000 rpm离心15 min分离血浆。血浆AVP检测采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法。血浆AVP浓度以pg/mL表示。

1.5.3 豚鼠耳蜗形态

豚鼠麻醉状态下快速打开胸腔,充分暴露心脏,4%多聚甲醛(pH=7.2)灌注,打开左侧听泡,取出颞骨,将颞骨标本置于 4%多聚甲醛固定液中,固定过夜后将标本置于10%乙二胺四乙酸(pH=7.4),室温下脱钙约3周,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋。沿耳蜗蜗轴中央平面切片,每片厚约 4.5 μm,HE染色后光镜观察耳蜗形态。运用IPP系统测量耳蜗中轴两侧第二转蜗管横截面积及前庭阶横截面积,计算蜗管横截面积/(蜗管横截面积＋前庭阶横截面积)比值(R值),两侧取平均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0软件分析结果。各组数据符合正态分布及方差齐,以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,均数间两两比较采用LSD检验法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般行为学观察

适应性喂养期间,豚鼠均精神状态良好,毛发密集而有光泽,步态自如,饮食正常,体质量自然增加,自发活动多,耳廓反应灵敏。造模后,模型组豚鼠普遍出现精神萎靡,轻微脱毛,步态迟缓,进食减少,体质量增长缓慢甚至出现下降,活动减少,耳廓反应迟钝。干预后,各频率电针组豚鼠精神状况、皮毛光亮程度、饮食、体质量、自发活动情况与模型组比较无差别,但耳廓反应灵敏度与模型组比较,有所改善。

2.2 血浆AVP浓度比较

经单因素方差分析,各组血浆 AVP浓度比较差异具有统计学意义(F=12.022,P=0.000＜0.01)。与空白组比较,模型组豚鼠血浆 AVP浓度增加(P＜0.01);与模型组比较,各电针组豚鼠血浆 AVP浓度均降低(P＜0.05);各电针组比较,2/15 Hz电针组较2 Hz电针组、15 Hz电针组降低,差异有统计学意义(P＜0.05);2 Hz电针组、15 Hz电针组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 各组豚鼠血浆AVP浓度比较 (±s,pg/mL)

表1 各组豚鼠血浆AVP浓度比较 (±s,pg/mL)

注:与空白组比较 1)P＜0.01;与模型组比较 2)P＜0.05,3)P＜0.01;与2 Hz电针组比较4)P＜0.01;与15 Hz电针组比较5)P＜0.05

组别 n AVP浓度空白组 8 36.66±3.19模型组 8 42.37±1.671)2 Hz电针组 8 39.01±2.082)15 Hz电针组 8 36.80±3.643)2/15 Hz电针组 8 33.98±1.443)4)5)

2.3 各组豚鼠耳蜗形态

经单因素方差分析,各组R值比较差异具有统计学意义(F=10.495,P=0.000＜0.01)。与空白组比较,模型组豚鼠耳蜗R值增加(P＜0.01);与模型组比较,各电针组豚鼠耳蜗R值均降低(P＜0.05);各电针组比较,2/15 Hz电针组较2 Hz电针组、15 Hz电针组降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。2 Hz电针组、15 Hz电针组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(见表2)。

空白组豚鼠均未出现膜迷路积水,前庭阶、鼓阶、蜗管结构无异常;模型组出现膜迷路积水,表现为前庭膜向前庭阶方向不同程度的隆起扩张;2 Hz电针组、15 Hz电针组、2/15 Hz电针组前庭膜隆起程度均较模型组不同程度的减轻;2/15 Hz电针组前庭膜隆起程度较2 Hz电针组、15 Hz电针组减轻,2 Hz电针组、15 Hz电针组前庭膜隆起程度无明显差异(见图1)。

表2 各组耳蜗R值比较 (±s)

表2 各组耳蜗R值比较 (±s)

注:与空白组比较 1)P＜0.01;与模型组比较 2)P＜0.05,3)P＜0.01;与2 Hz电针组比较4)P＜0.05;与15 Hz电针组比较5)P＜0.05

组别 n R值空白组 8 0.29±0.04模型组 8 0.49±0.061)2 Hz电针组 8 0.40±0.102)15 Hz电针组 8 0.39±0.073)2/15 Hz电针组 8 0.32±0.063)4)5)

3 讨论

中医学中无“梅尼埃病”具体病名的记载。根据MD临床表现,散见于中医古籍所描述的“眩晕”“瞑眩”等范畴。现多将由MD引起的眩晕归入“耳源性眩晕”。本虚标实为MD眩晕的基本病理性质,因此临床对该病的治疗多以补益为主。《灵枢·海论》记载:“髓海不足,则脑转耳鸣”,故临床治疗眩晕首选与脑髓有关的穴位。百会归属督脉,具有补益脑髓、平肝熄风、开窍、止眩的功效,为治眩晕要穴。MD病位在耳,听宫内通心、脑及肝胆之气,针刺听宫可疏利肝胆之气,宣通耳窍,多用于内耳疾病的治疗。临床上常以百会配伍听宫治疗内耳眩晕症[7]。本研究结果显示,电针“百会”“听宫”穴能显著减轻膜迷路积水模型豚鼠的耳蜗积水程度,与课题组前期研究结果相符[8]。

研究者在应用电针治疗耳聋过程中,观察不同电针频率对患者耳聋及其伴随症状如眩晕、耳鸣、耳闷的影响,结果发现疏密波在提高患者听力水平,改善眩晕等伴随症状方面均具有良好效果,并推荐疏密波作为电针治疗突发性耳聋的首选参数[9]。有文献报道,疏密波类似于传统医学所称的“补法”,密波类似于“泻法”,认为疏密波可补益气血、改善能量代谢,具有兴奋作用,密波则具抑制作用[10]。MD病机以虚为主要特点,疏密波电针刺激辅助穴位,能加强补益作用,有效治疗MD。韩济生院士在研究电针镇痛的过程中指出,长时间应用单调的频率脉冲电针刺激容易使机体产生针刺耐受现象,降低针刺效应,2 Hz/15 Hz或2 Hz/100 Hz相互交替的波形镇痛作用最佳[11]。但目前有关何种频率电针治疗MD最佳,还鲜见有文献报道。课题组的前期研究中,观察了电针对豚鼠膜迷路积水的干预作用,选择的电针刺激参数为2 Hz频率与15 Hz频率交替的疏密波,并证实了该频率、波形电针刺激对膜迷路积水干预的有效性[8,12]。那么2 Hz/15 Hz疏密波对膜迷路积水的干预作用是否优于单一的2 Hz或15 Hz电针频率?因此,本次研究在前期工作基础上,进一步观察了2 Hz、15 Hz、2 Hz/15 Hz对膜迷路积水的干预效应差异。结果显示,2 Hz、15 Hz、2 Hz/15 Hz电针干预豚鼠膜迷路积水均有良好的治疗作用。各电针组间比较,2 Hz/15 Hz电针疗效最佳。

图1 各组豚鼠耳蜗形态变化(HE染色,×50)

AVP是一种9肽类激素,主要在下丘脑的视上核和室旁核中合成。研究发现,MD患者眩晕症状急性发作期与缓解期的血浆 AVP均较正常水平升高,且急性发作期 AVP升高的幅度远大于缓解期间[13],而通过改善生活方式减少AVP释放可有效缓解MD患者症状发作[14]。AVP水平病理性升高在MD发生发展中起着重要作用[15]。动物实验表明,经腹腔注射 AVP在诱发膜迷路积水的同时[16],血浆AVP也出现较正常组豚鼠升高,膜迷路积水程度与血浆AVP升高水平相关[12]。下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)是机体内分泌系统的中枢部位,在维持人体内环境稳态,协调机体功能方面起关键作用。AVP可调节垂体激素分泌,被认为是HPA轴的决定性调节因素之一。外源性AVP长时间注射引起的垂体激素释放异常影响 HPA轴反馈调控机制,下丘脑分泌 AVP功能出现异常,可能是引起 AVP病理性升高的重要原因之一。电针局部穴位,可通过调整HPA轴,改善机体内分泌功能,对 HPA轴的调节与机体状态密切相关。Park HJ等[17]发现,针刺通过调节HPA轴使新生期经母婴分离处理诱导的抑郁焦虑模型幼年大鼠血浆皮质醇、促肾上腺皮质激素浓度降低,下丘脑室旁核 AVP免疫反应减弱。金小千[18]研究发现电针可使慢性疲劳大鼠血清皮质醇与促肾上腺皮质激素浓度水平下降,调节下丘脑内神经递质的表达,对 HPA轴具有良性调节作用。本实验中电针百会、听宫穴可使膜迷路积水豚鼠异常升高的AVP水平降低,可能与对HPA轴的良性调节有关。AVP通过刺激血管加压素受体 2激活 AVPAQP2(aquaporin-2)系统,在抗利尿及维持血浆渗透压的稳定方面起关键作用[19-20]。因此,电针可能通过调节HPA轴使血浆AVP水平降低,AVP-AQP2系统受到良性调节而使膜迷路积水程度减轻。

综上所述,各电针组治疗均能减轻豚鼠膜迷路积水,其中2 Hz/15 Hz电针效果最佳,推测其作用机制可能与下调血浆AVP的表达有关。